[發明專利]一種真空滲透輔助農桿菌介導甘蔗遺傳轉化的方法無效

申請號：	201310088894.X	申請日：	2013-03-20
公開（公告）號：	CN103205459A	公開（公告）日：	2013-07-17
發明（設計）人：	樊麗娜;齊永文;李奇偉;鄧海華;勞方業;李昱;羅青文;周文靈;何慧怡;陳月桂	申請（專利權）人：	廣州甘蔗糖業研究所
主分類號：	C12N15/84	分類號：	C12N15/84;A01H5/00
代理公司：	廣州市一新專利商標事務所有限公司 44220	代理人：	唐弟
地址：	510316 廣***	國省代碼：	廣東;44
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種真空滲透輔助桿菌甘蔗遺傳轉化方法
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【說明書】：

技術領域

?本發明屬于植物生物技術領域，尤其是甘蔗愈傷組織遺傳轉化方法。?

背景技術

甘蔗是我國最為重要的糖料作物，2011/2012榨季，我國蔗糖產量為1151萬噸，蔗糖產量占到全國食糖總產的91%，可見甘蔗產業在保障全國食糖供應體系中具有至關重要的地位。但是，甘蔗種植過程中經常出現病蟲害頻繁發生、季節性干旱以及低溫冷害等問題，造成生產損失嚴重，蔗農和制糖企業收入受損，導致我國制糖產業國際競爭力下降。因此，生產上迫切需要提高品種的產量和抗逆境脅迫能力，培育高產、高糖、高抗和高經濟收益的優良品種。?

甘蔗栽培種是由甘蔗屬熱帶種、細莖野生種、印度種、中國種等多個物種間的種間雜交形成的復合體，染色體數量多，基因組結構復雜。甘蔗栽培種對光周期反應敏感，一般只能在低緯度地區才能開花，而且不同基因型的開花時間相差較大，一些重要種質材料經常由于花期不育等問題難以配置雜交組合。因此，甘蔗常規雜交育種難度大，周期長，選育一個品種往往需要10年左右的時間。而且，由于甘蔗基因組大且復雜，沒有純合體，無法針對某個單一性狀進行定向回交，新選育的種質往往由于單一性狀的缺陷無法推廣應用。基因工程是定向、快速改良植物性狀的方法，通過轉基因技術在提高植物抗病蟲以及干旱、寒害等逆境脅迫方面已經有了許多成功報道。由于甘蔗是營養繁殖，T₀代轉基因植株就可以穩定目標基因性狀，與水稻、玉米等其他作物相比，甘蔗轉基因減少了外源基因自交、純合的選育過程，更容易獲得既保持供體植株原有主要目標性狀，又對某個單一性狀進行改良的效果。因此應用轉基因技術定向改良甘蔗周期短，效果好，是甘蔗遺傳改良的重要途徑。?

目前甘蔗的遺傳轉化技術主要是采用基因槍法和農桿菌介導法。基因槍法雖然操作簡單，但是外源基因插入拷貝數多，易產生嵌合體，遺傳穩定性差。與基因槍轉化方法相比，農桿菌介導轉化方法外源基因插入的拷貝數低，對受體傷害小，設備簡單。自1998年報道農桿菌介導甘蔗遺傳轉化成功以來，農桿菌介導法在甘蔗上的應用已有多個報道。但是，目前農桿菌介導甘蔗遺傳轉化上的應用仍存在一些不足，轉化效率一般都在3%以下，轉化成本高、時間長。農桿菌介導甘蔗遺傳效率低的主要原因之一是在農桿菌菌株和甘蔗愈傷細胞侵染過程中工程菌株和愈傷細胞不能充分接觸，另外在侵染后為了將共培養后的愈傷組織上攜帶的農桿菌去除干凈，對愈傷組織要進行水洗、干燥等處理，處理過程中一方面損失了一部分轉化成功的愈傷細胞，另外對愈傷細胞的生長也有傷害，導致后期獲得轉基因植株量減少。?

發明內容

本發明目的在于提供一種真空滲透輔助根癌農桿菌介導轉化甘蔗的方法，其克服現有技術的不足，提高甘蔗農桿菌遺傳轉化效率。?

一種真空滲透輔助農桿菌介導甘蔗心葉愈傷組織遺傳轉化的方法，包括以下步驟：?

（1）????甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導及增殖；

（2）????含有目標基因的根癌農桿菌的活化與培養；

（3）????真空滲透輔助農桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織；

（4）????抗性材料的篩選與出苗；

（5）????抗性材料鑒定。

步驟（1）所述甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導及增殖方法是：?

（1．0）?取甘蔗莖尖生長點以上不大于6cm的幼嫩心葉作為外植體，無菌條件下，將消毒好的外植體切成0.5～2.5mm的圓盤片；

（1．1）?將步驟（1．0）的外植體接種于愈傷誘導培養基上，置于26～28℃的黑暗條件下培養，挑選生長狀況良好的胚性愈傷組織繼代一次；

（1．2）?挑步驟（1．1）的生長狀況良好的繼代后胚性愈傷組織轉接入新的愈傷誘導培養基上，進行活化培養；