[發明專利]檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201310088827.8
• 申請日: 2013-03-19
• 公開（公告）號: CN103215378A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 張瓊;李蘭娟;項春生;吳南屏
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。

背景技術

一、核苷和核苷類似物類藥物作用機制：

人類免疫缺陷病毒（HIV）屬于逆轉錄病毒，又分為HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地區的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染，現有藥物主要是抑制HIV-1型病毒的復制。自從1995年開始應用新的抗病毒治療方案，即聯合使用逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的HAART以來，HIV感染的臨床進程被大大改變。這些藥物通過阻斷病毒復制使得免疫系統重建其CD₄⁺T細胞庫并恢復對病原體的免疫力，明顯降低了HIV/AIDS相關疾病的發病率和病死率。截至目前，美國FDA已經批準了4大類共26種抗病毒藥物用于艾滋病的臨床治療，其中包括核苷類逆轉錄酶抑制劑（nucleoside?reverse?transcriptase?inhibitor，nRTI）、非核苷類逆轉錄酶抑制劑（non-nucleoside?reverse?transcriptase?inhibitor，NNRTI）、蛋白酶抑制劑（proteaseinhibitor，PI）和融合抑制劑（fusion?inhibitors）。我國已有5種國產抗病毒藥物進入臨床。

在HIV-1的復制循環中，逆轉錄酶在完成RNA指導的DNA合成、RNA水解反應和DNA指導的DNA合成過程中起著十分重要的作用。因此，HIV-1逆轉錄酶是抗HIV/AIDS藥物設計的一個重要生物靶點。目前市場上出現的以HIV-1逆轉錄酶為靶點的藥物按作用機制和化學結構可分為核苷類逆轉錄酶抑制劑和非核苷類逆轉錄酶抑制劑。

核苷類逆轉錄酶抑制劑是最先問世、開發品種較多的一類藥物，臨床證實對HIV復制具有很強的抑制作用，核苷類逆轉錄酶抑制劑（nRTIs），是HIV病毒逆轉錄酶作用底物脫氧核苷酸的類似物，在體內轉化成活性的三磷酸核苷衍生物，與天然的三磷酸脫氧核苷競爭性與HIV逆轉錄酶（reverse?transcriptase，RT）結合，抑制RT的作用，阻礙前病毒的合成。已上市的nRTIs藥物有：齊多夫定、去羥肌苷、扎西他濱（DDC)、司坦夫定、拉米夫定、阿巴卡韋等。nRTIs的結構與核苷類似，為雙脫氧核苷衍生物，可與細胞內核苷競爭性地結合逆轉錄酶，從而終止逆轉錄反應。通過阻斷病毒RNA基因的逆轉錄，即阻斷病毒的雙股DNA的形成，使病毒失去復制的模板。此類藥物首先進入被感染的細胞，然后磷酸化形成具有活性的雙脫氧核苷三磷酸化合物，競爭性抑制艾滋病病毒逆轉錄酶，可導致未成熟的DNA鏈合成終結，從而病毒復制受到抑制。早期用于治療AIDS及其相關綜合征，對治療HIV陽性/AIDS有一定的效果，可降低死亡率及機會性感染率，但不能治愈AIDS。研究表明，核苷類逆轉錄酶抑制劑聯用，副作用大，易出現交叉耐藥。

二、HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑的耐藥類型及機制：

隨著我國免費艾滋病抗病毒治療的開展，HIV-1病毒耐藥性的監測越來越受到重視。HIV-1病毒耐藥性的產生取決于兩方面：病毒復制過程中的高頻突變和抗病毒藥物產生的選擇壓力。HIV-1是RNA病毒，其基因組由單鏈RNA轉變為RNA-DNA復合物，進而反向轉錄為前病毒DNA，再由前病毒轉錄為病毒基因組RNA，整個過程均由病毒自身的RT催化。因其RT缺乏核酸外切酶活性，對轉錄錯誤無校正功能，所以轉錄的忠實性差，轉錄中的堿基錯配常導致基因突變，因此HIV-1病毒復制過程中表現出很高的突變頻率，每個堿基對在每輪復制中發生突變的頻率約為3.4×10^-5。另一方面，HIV-1病毒復制迅速，感染初期每天可新形成10⁹～10¹⁰病毒顆粒。HIV-1病毒的高速復制及復制過程中的高頻突變，導致原發感染的幾個月內就可形成非常大量的基因突變病毒。一旦突變發生在逆轉錄酶和蛋白酶的編碼基因序列，就有可能引起逆轉錄酶和蛋白酶分子發生改變，導致HIV-1病毒對作用于這兩種酶的抑制劑不再敏感，產生耐藥性。開始抗病毒治療后，野生型病毒被顯著抑制，臨床上可見到病毒載量明顯下降，如果藥物對病毒抑制不完全，與耐藥有關的突變型仍可以持續復制。在藥物產生的選擇壓力下，耐藥突變型最終取代野生病毒株成為優勢群體，臨床上可表現為病毒載量的反彈。