[發明專利]全人源的抗人血管內皮生長因子受體2胞外區的單鏈抗體及其應用

無效

• 申請號: 201310087619.6
• 申請日: 2013-03-19
• 公開（公告）號: CN104059146A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 王旻;張娟;李海鑫;曹婉璐
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/13;C12N15/63;C12N1/21;A61K39/395;A61P35/00;A61P37/02
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技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種新的可與人血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)胞外區特異結合的高親和力全人源單鏈抗體，能抑制VEGFR的活化，從而抑制高表達VEGFR的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的生長，是一種具有抗腫瘤活性的基因工程抗體。

背景技術

以新生血管為靶點對腫瘤進行生物治療成為新的研究熱點，其優勢主要表現在：腫瘤血管內皮細胞是藥物經靜脈途徑首先到達的部位、不易產生耐藥性、腫瘤血管內腫瘤血管內皮細胞的有限損害就可造成大量腫瘤細胞的生長抑制、抗腫瘤血管治療具有一定的廣譜性等。目前，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是迄今鑒定出來的最重要的血管生成因子，可作為腫瘤代謝及轉移的標記。血管內皮生長因子受體(VEGFR)是VEGF的特異性受體，通過與相應的VEGF結合刺激血管內皮細胞增殖、遷移、促進新生血管的生成，與機體多種常見腫瘤的發病及腫瘤的轉移有著密切的關系。

最近，以VEGF/VEGFR作為靶標的抗腫瘤藥物的研發取得了很大的進展，已有數種上市進入臨床試驗。針對VEGF/VEGFR信號傳導途徑研發的抗腫瘤藥物包括中和VEGF/VEGFR的抗體(如貝伐單抗、IMC21121B)、可溶的VEGFR類蛋白(VEGF-Trap)和酪氨酸激酶抑制劑(索拉非尼、舒尼替尼)等，其中VEGF的人源化抗體貝伐單抗是第一個被美國FDA批準上市的抗血管生成藥物。

目前發現的VEGFRs主要有5種類型，有3種屬于酪氨酸激酶受體，分別是VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(kinase insert domain-containing receptor，KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)。VEGFR2(人VEGFR2稱為KDR)作為VEGF的主要受體之一，在介導VEGF的內皮細胞增殖、遷移、分化、微管形成、血管通透性增加等一系列生物活性中發揮重要作用。

單克隆抗體根據其序列來源的不同分為鼠源抗體，嵌合抗體(小鼠的可變區和人的恒定區)，人源化抗體(人和鼠的互補性決定區)，人源抗體。鼠源抗體經臨床多次用藥后，人體內易產生抗鼠抗體，使其臨床療效減弱或消失，而人源抗體可以降低抗體藥物在人體的免疫原性，因此2000年以來人源抗體得到了長足的發展。2004年，美國FDA批準的抗VEGF抗體貝伐單抗(Avastin)在臨床與化療藥物聯合治療結腸直腸癌有明顯的延長病人生命的效果。然而，封閉VEGF治療腫瘤的同時也抑制了VEGF的正常生理功能，病人使用后會引起高血壓、出血和血栓形成。因此，靶向VEGFR2的全人源抗體能降低免疫原性，而且特異性拮抗VEGFR的抗體相對于拮抗VEGF而言其特異性及針對性更強，并能避免對VEGF的全面封閉所產生的副作用。另外分子量只有全長抗體的1/6的抗VEGFR2單鏈抗體可以通過E.coli發酵降低生產成本。

發明內容

發明目的

本發明提供一種具有潛在醫學和藥學價值的全人源抗人VEGFR2胞外區的單鏈抗體。本發明單鏈抗體的特征為特異性結合人VEGFR2胞外區，在體外能夠抑制人臍靜脈內皮細胞HUVEC的生長。

技術方案

一種全人源的抗人血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)胞外區的單鏈抗體，其特征在于：

抗VEGFR2胞外區的單鏈抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區，并且重鏈可變和輕鏈可變區通過柔性肽連接，重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO：1；輕鏈可變區為SEQ ID NO：2的氨基酸序列，柔性肽的氨基酸序列為SGGGGSGGGGSGGS，SEQ ID NO：9。

所述的抗VEGFR2胞外區的單鏈抗體，具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗VEGFR2胞外區的單鏈抗體，具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。

所述的抗VEGFR2胞外區的單鏈抗體具有重鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗VEGFR2胞外區的單鏈抗體具有輕鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。