[發明專利]一種富硒羊肚菌多糖的制備方法

無效

• 申請號: 201310086787.3
• 申請日: 2013-03-17
• 公開（公告）號: CN103130909A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 孫永海;丁健峰;付天宇
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A01G1/04
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 齊安全;胡景陽

1.一種富硒羊肚菌多糖的制備方法，其特征在于，所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法的步驟如下：

1）富硒羊肚菌的制備

（1）制備培養基：

a.制備斜面培養基;

b.制備深層發酵培養基;

（2）菌種活化：

將所有器具通過紫外線殺菌30min后，在無菌環境下用接種環挑取保藏的粗柄羊肚菌926號，轉接到新鮮的斜面培養基上，在25℃恒溫培養箱中培養24h；

（3）深層發酵：

菌種活化后，取約5mm²大小的菌種10塊接入深層發酵培養基，同時加入的亞硒酸鈉，使深層發酵培養基中硒濃度達到80μg/ml，250mL三角瓶裝料100mL，置于振蕩培養箱中，培養溫度為26℃，振蕩培養箱的振蕩頻率100rpm，培養時間5天，得到富硒羊肚菌菌絲球；

2）富硒羊肚菌胞內粗多糖的提取

（1）富硒羊肚菌菌絲球經清洗、烘干、粉碎、過篩后稱量，按菌絲球與蒸餾水為1：30的比例加入蒸餾水，進行微波協同超聲波輔助提取，然后置于水浴鍋中，在90℃下熱水浸提140min，將浸提液以4000r/min的轉數在離心機中離心15min，取上清液；

（2）上清液經低溫濃縮后，在攪拌下加入3倍體積的95%乙醇，將醇析液在4℃冰箱中靜置12h，采用離心機分離收集沉淀物；

（3）將收集的沉淀物復溶于蒸餾水中，按樣品與Sevag試劑為5:1的比例充分混勻，置于分液漏斗中，靜置20min后棄去下層有機層及兩相界面上的蛋白質變性層，取上層液重復本步驟處理7～8次，直到有機層與水層間無白色膠狀物產生為止，此時上層液體為羊肚菌胞內粗多糖溶液；

（4）取上層羊肚菌胞內粗多糖溶液濃縮、醇沉后收集沉淀物，然后分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次，最后將沉淀物小心刮入稱量皿中，置于40℃真空干燥箱中干燥2h，即得到固態富硒羊肚菌胞內粗多糖；

3）富硒羊肚菌胞內粗多糖的純化

1）采用AB-8大孔樹脂分離，得到富硒羊肚菌多糖洗脫曲線，收集曲線洗脫峰部位的洗脫液，進行下一步純化；

2）Sephadex?G-100凝膠柱層析，繪制富硒羊肚菌多糖洗脫曲線，收集曲線洗脫峰部位的洗脫液，得富硒羊肚菌多糖。

2.按照權利要求1所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法，其特征在于，所述的制備斜面培養基是指：

按重量比采用馬鈴薯20%、加入蒸餾水，將土豆切成小塊煮沸約30min，煮至熟而不爛為止，四層紗布過濾，再按重量比配以葡萄糖2%、瓊脂1.5%、KH₂PO₄0.3%、MgSO₄0.15%，加蒸餾水定容至100mL、混合均勻，分裝于試管中，每管裝液量10毫升，121℃滅菌30min，將試管與水平面成10°角放至凈化工作臺中，放涼準備菌種活化使用。

3.按照權利要求1所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法，其特征在于，所述的制備深層發酵培養基是指：

按重量比采用馬鈴薯10%、加入蒸餾水，將土豆切成小塊煮沸約30min，煮至熟而不爛為止，四層紗布過濾，再按重量比配以蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、KH₂PO₄0.05%與MgSO₄0.05%，加蒸餾水定容，混合均勻，使深層發酵培養基中硒濃度達到80μg/mL，在容量為250mL的三角瓶中裝液量為100mL，121℃滅菌30min，在凈化工作臺中放涼準備深層發酵使用。

4.按照權利要求1所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法，其特征在于，所述的采用AB-8大孔樹脂分離，得到富硒羊肚菌多糖洗脫曲線，收集曲線洗脫峰部位的洗脫液，進行下一步純化是指：

將得到的濃度為1mg/mL的富硒羊肚菌胞內粗多糖溶液離心后吸取上清液，注入AB-8大孔樹脂柱中，每次注入量為5mL，用蒸餾水進行洗脫，蒸餾水的體積為大孔樹脂柱體積的3至5倍，流速控制在2mL/min，每2min收集1管洗脫液，利用硫酸-蒽酮法測定各管洗脫液中的多糖含量，利用UV2300的分光光度計對各管洗脫液進行多糖含量檢測，以洗脫管數作為橫坐標、以吸光度數值作為縱坐標，可以得到富硒羊肚菌多糖洗脫曲線，收集曲線洗脫峰部位的洗脫液，進行下一步純化。

5.按照權利要求1所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法，其特征在于，所述的Sephadex?G-100凝膠柱層析，繪制富硒羊肚菌多糖洗脫曲線，收集曲線洗脫峰部位的洗脫液，得富硒羊肚菌多糖是指：

將經過AB-8大孔樹脂分離后得到的富硒羊肚菌多糖溶液，離心后取上清液，注入Sephadex?G-100凝膠柱中層析，每次注入量為5mL，用體積為SephadexG-100凝膠柱體積的3至5倍的雙蒸水進行洗脫，流速控制在2mL/min，每2min收集1管洗脫液，利用硫酸-蒽酮法測定各管洗脫液中的多糖含量，利用UV2300的分光光度計對各管洗脫液進行多糖含量檢測，以洗脫管數作為橫坐標、以吸光度數值作為縱坐標，繪制富硒羊肚菌多糖洗脫曲線，收集曲線洗脫峰部位的洗脫液，經透析、醇沉、冷凍干燥后，即得富硒羊肚菌多糖。