[發明專利]一種鹽酸柔紅霉素菌種及其高產方法

無效

• 申請號: 201310086639.1
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN104059871A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 余宏;徐超波;陳歡斌;王波;姚定余
• 申請（專利權）人: 江蘇禾昌生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/01;C12N13/00;C12N15/03;C12R1/465;C12R1/545
• 代理公司: 北京市振邦律師事務所 11389
• 代理人: 李朝輝

技術領域

本發明涉及生物工程制藥技術領域，特別涉及一種鹽酸柔紅霉素菌種及其高產方法。

背景技術

蒽環類抗生素（Anthracyclines）是一類重要的抗腫瘤藥物，它們均由蒽環酮的發色團通過糖苷鍵和一種或幾種不同的糖連接而成。大多數蒽環類的抗生素具有很強的骨髓抑制和心臟毒性而不能應用于臨床，只有柔紅霉素-阿霉素型蒽環類抗生素成為臨床上最有應用價值的抗腫瘤藥物，包括柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、洋紅霉素等。柔紅霉素在臨床上主要用以治療急性白血病，對急性淋巴細胞性白血病和急性粒細胞性白血病，柔紅霉素可作為首選藥物，柔紅霉素還可以治療淋巴肉瘤、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤等。

柔紅霉素（Daunorubicin，DNR），又稱道諾霉素（Daunomycin），是某些鏈霉菌的次級代謝產物，例如波賽鏈霉菌（Streptomyces peucetius），天藍淡紅鏈霉菌（S.coeruleorubidus），灰色鏈霉菌，鏈霉菌C5等等。目前工業上采用微生物發酵法生產柔紅霉素，國外主要使用的菌種是波賽鏈霉菌；國內主要使用的是正定變種HB1482。

由于柔紅霉素是具有細胞毒性的抗腫瘤抗生素，初始的柔紅霉素產生菌的發酵單位一般較低，導致生產成本很高，并不能立即作為工業化生產用菌。對柔紅霉素產生菌進行包括分子育種、常規誘變育種在內的選育工作，是提高柔紅霉素發酵產量、降低生產成本的最有效的途徑之一。

為了提高柔紅霉素產生菌的發酵產量，國內外研究者做了大量研究工作。如采用柔紅霉素篩選耐受菌株以提高菌株的蒽環類抗生素的產抗能力（斯圖茲 曼·恩格沃，《鏈霉菌的次生代謝調控及柔紅霉素的產生》《細菌學雜志》，刊號：1992,174，頁數：144-154）攜帶dnrl基因的高拷貝表達質粒轉化野生型柔紅霉素產生菌，提高轉化子的柔紅霉素產抗水平；以SIPI1482為出發菌株，采用紫外誘變和自身耐藥等復合處理，獲得高產突變株SIPI-89068，其發酵產柔紅霉素產量水平提高了3-4倍（李莉，許文思，《柔紅霉素產生菌SIPI89068的選育及發酵》，《中國抗生素》雜志，刊號：1993,18(4):頁數：306-307）等。

由于抗腫瘤抗生素產生菌的菌種選育有相當大的難度，通過上述工作，不同菌種的柔紅霉素發酵產量雖然有了不同程度的提高，但與其他種類的抗生素發酵水平相比，仍然有相當大的差距。

近年來隨著分子生物學的快速發展，在單個基因水平、基因組水平對柔紅霉素的生物合成途徑等有了越來越多的認識，使組合利用新技術及傳統誘變手段對柔紅霉素產生菌進行菌種選育，進而獲得高產柔紅霉素菌種成為可能。

發明內容

針對現有柔紅霉素發酵產量不高的上述缺陷和問題，本發明實施例的目的是提供一種鹽酸柔紅霉素菌種及其高產方法，通過紫外誘變，離子注入誘變，結合基因組改組，獲得高產柔紅霉素的菌種。

為了達到上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：

一種鹽酸柔紅霉素菌種的高產方法，包括以下步驟：

Q1：原生質體的制備，包括以下分步驟:

Q11：取培養菌絲體，以5000-7000轉/分鐘的速率，離心5-8分鐘后得沉淀，加生理鹽水進行洗滌，再次離心后棄澄清部分，并以漩渦振蕩的方式分散菌絲體；

Q12：在Q11步驟中處理后的懸浮菌絲體中加入生理鹽水，再加入溶菌酶溶液，用移液槍吹吸5次混勻后，于30°水浴中進行酶解，每隔10分鐘， 用移液器吹吸3次，90分鐘后終止酶解;

Q13：以2000轉/分鐘的速率，離心5分鐘上述Q12步驟結束后的處理液，使殘留的菌絲斷片沉于管底，取上部澄清部分，即為原生質體懸浮液，轉移到另一滅菌離心管中備用，并以3000轉/分鐘的速率，離心10分鐘該原生質體懸浮液，溫和地去除溶菌酶液，沉淀出原生質體；

Q14：取Q13步驟中沉淀出原生質體部分，輕輕震蕩離心管，使原生質體分散開成原生質體懸浮液，加生理鹽水進行稀釋并對原生質體計數，使原生質體的濃度為100個/毫升；

Q2：原生質體的再生，包括以下分步驟：

Q21：取0.5ml-1ml Q14步驟中得到的原生質體懸液，與25ml-50ml軟瓊脂混合均勻，傾倒于R2YE平板上層的培養基中；

Q22：另取一R2YE平板，蓋住Q21步驟中的R2YE平板，將雙層培養基平板于28°倒置培養；

Q3：原生質體的紫外誘變，包括以下分步驟：