[發明專利]一種檢測N-酰基高絲氨酸內酯的雙標記微生物細胞傳感器

在審

• 申請號: 201310086354.8
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN103215214A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 莊國強;鄧雪梅;馬安周
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12Q1/02;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種響應環境中N-酰基高絲氨酸內酯的雙標記微生物細胞傳感器的構建及使用。?

背景技術

近年來，人們發現許多細菌在細胞密度達到一定的閾值時可通過對化學信號分子的產生，釋放，感知和反應來調控相關基因的表達從而改變細菌的行為使其適應環境變化,這一現象被稱為“群體感應”(QS：quorum?sensing)。群體感應調控許多細菌行為包括：細菌運動、抗生素產生、毒力的產生、細菌結合、孢子的生成、生物膜的生成和環境適應性等。群體感應這些作用的發生依賴于信號分子。目前有三類公認的信號分子：革蘭氏陽性菌的主要信號分子小肽；革蘭氏陰性菌的主要信號分子N-酰基高絲氨酸內酯（AHL）；革蘭氏陽性菌和陰性菌間都有的autoinducer-2?(AI-2)。因N-酰基高絲氨酸內酯參與調控的細菌行為的廣泛性和結構特性，對其的檢測是研究AHL介導的QS行為的基礎。?

檢測AHL有兩種方法:一種是物理化學方法，如高效液相色譜法（HPLC），薄層層析法（TLC）等,?其優點是具備高檢測靈敏度和高特異性，但也存在不足，如需要對樣品進行分離提純，對樣品量造成損失并且不能進行環境原位檢測；另一種方法是基于生物有機體和熒光蛋白的生物傳感器，其優勢是不需對樣品進行提純可直接進行原位檢測。微生物細胞具有易操作，繁殖及生存能力強，易儲存和穩定性高的特點，以微生物細胞為生物學感應元件的微生物細胞傳感器可以極大簡化傳感器的制作過程，提高傳感器的檢測效率。AHL微生物細胞傳感器已成為檢測AHL的重要工具。?

目前檢測AHL的傳感器主要有兩種：一種是AHL啟動子基因和同源調控蛋白基因以及報告基因組成的重組質粒。當環境中有AHL時，AHL與重組質粒編碼的轉錄調控蛋白結合形成復合物，這一復合物再與啟動子相互作用啟動報告基因表達，產生可檢測的信號，但其缺點是不能表征菌的生長情況，因為菌的生長情況可能影響到包括報告基因蛋白在內的蛋白表達情況，從而影響AHL檢測；另一種是AHL啟動子、報告基因和組成型表達熒光蛋白基因組成的重組質粒。此種質粒無AHL調控蛋白，只能轉化到菌體本身含有AHL調控系統的菌中才能發揮作用，不能對不含AHL調控系統的菌做出表征。?

發明內容

本發明的目的在于針對現有AHL傳感器有的不能表征菌的生長情況，有的不能表征不含AHL系統的菌的問題，利用三部分元件：一是以丁香假單胞菌丁香致病變菌B728a?AHL合成酶啟動子ahlI為啟動子，櫻桃紅色熒光蛋白基因mcherry為報告基因，構建出的響應AHL的檢測元件P_ahlI:mcherry，二是以新霉素磷酸轉移酶啟動子nptII作啟動子，綠色熒光蛋白基因gfp?為報告基因，構建出表征宿主生長情況的組成型表達綠色熒光蛋白元件P_nptII:gfp，三是利用丁香假單胞菌丁香致病變菌B728a的AHL調控蛋白基因ahlR元件，可檢測AHL對不含AHL系統的菌的影響情況，構建出既能檢測AHL又能表征菌的生長情況的雙色熒?光標記的微生物細胞傳感器。?

構建該細胞傳感器的具體操作步驟為：??

1.組成型表達綠色熒光蛋白元件P_nptII:gfp的構建???

以質粒載體pBQ9為模板，PCR擴增得到綠色熒光蛋白基因gfp片段，PCR產物和pUC19質粒載體分別用SphI和?PstI雙酶切并純化酶切產物，將gfp片段連入酶切后的pUC19形成載體V1'。以質粒載體pTS為模板，PCR擴增得到新霉素磷酸轉移酶啟動子片段P_nptII。PCR產物和載體V1'分別用SalI?和?PstI雙酶切并純化酶切產物，將P_nptII連入V1'形成載體V1。??

2.響應AHL元件P_ahlI:?mcherry的構建?