[發明專利]黑眶蟾蜍胱抑素及其基因和應用

無效

• 申請號: 201310085704.9
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN103172730A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 宋玉竹;劉娃;張阿梅;韓芹芹;紀森林
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C12N15/15
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明提供一種黑眶蟾蜍胱抑素基因及其應用，屬于生物醫學技術領域。

背景技術

黑眶蟾蜍，無尾目，蟾蜍科，蟾蜍屬，是傳統中藥材“干蟾”的主要來源之一，一般于夏、秋二季捕捉；味辛、涼，有毒，歸肝、脾、肺經，具有消腫解毒、止痛、利尿的功效，常用于慢性氣管炎、癰癤疔瘡、咽喉腫痛、水腫和小便不利等癥治療；民間也有用于癌癥（尤其是乳腺癌）等的驗方，但目前關于其功效的分子機制研究較少。

在腫瘤發生發展的過程中，組織蛋白酶B起著重要的作用，組織蛋白酶B能夠直接降解或激活纖溶酶原激活劑及基質金屬蛋白酶等而間接降解許多細胞外基質成分，從而參與腫瘤的侵襲轉移過程。此外它還可以促進腫瘤血管的增生，增強腫瘤細胞的運動能力，而且組織蛋白酶B轉錄、表達水平的高低與腫瘤的預后呈正相關。目前認為對組織蛋白酶B等半胱氨酸蛋白酶的抑制與抗腫瘤作用有關。

將本發明的黑眶蟾蜍胱抑素氨基酸全序列及其編碼基因分別對蛋白質數據庫和基因數據庫進行了比對搜索，均未發現有任何相同序列信息。

發明內容

本發明的目的在于提供一種黑眶蟾蜍胱抑素，該黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，其是一種單鏈多肽，分子量10882.84道爾頓，等電點7.57。

本發明另一目的是提供一種編碼所述黑眶蟾蜍胱抑素的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。?????????????????????????????????????

黑眶蟾蜍胱抑素基因的克隆方法如下:?

黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取、反轉錄及設計引物并利用PCR方法篩選黑眶蟾蜍胱抑素基因，其中正向擴增引物長度為23個核苷酸，其序列為5’–ATGGATCAAAAAGGAAATGTTCC-3’，反向擴增引物序列為5’-CTAAAAATAACAGATGGGGTCTTC-3’；所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定，基因測序結果表明編碼黑眶蟾蜍胱抑素的基因由309個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為：

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編碼黑眶蟾蜍成熟胱抑素為第1–306?位核苷酸，其氨基酸序列為如SEQ?ID?NO：2所示。

黑眶蟾蜍胱抑素的原核表達、純化方法如下：

構建原核表達載體，轉化入BL21感受態細胞，培養于含氨芐青霉素的LB培養基中，經IPTG誘導表達后，離心收集菌體，超聲破碎離心取上清，進行親和層析獲得融合黑眶蟾蜍胱抑素；經超濾后用腸激酶進行消化后，純化即得重組黑眶蟾蜍胱抑素，該胱抑素具有強烈的抑制組織蛋白酶B活性。

本發明另一目的是將黑眶蟾蜍胱抑素應用在制備組織蛋白酶B抑制劑中。

本發明中所用黑眶蟾蜍來源于云南省西雙版納州，從農貿市場購得。

本發明的有益效果在于:

由黑眶蟾蜍胱抑素編碼基因推導其氨基酸結構，并進行原核表達，純化后的黑眶蟾蜍胱抑素具有強烈的抑制組織蛋白酶B的活性，該黑眶蟾蜍胱抑素具有體外生產方便、抑制組織蛋白酶B活性強大的特點。

本發明提供的黑眶蟾蜍胱抑素在2uM濃度可抑制75%的組織蛋白酶B活性，8uM濃度黑眶蟾蜍胱抑素可抑制90%的組織蛋白酶B活性。

附圖說明

圖1是本發明黑眶蟾蜍胱抑素對組織蛋白酶B抑制活性結果示意圖。

具體實施方式