[發明專利]發酵生產二聚體化融合蛋白的方法

在審

• 申請號: 201310084035.3
• 申請日: 2013-03-15
• 公開（公告）號: CN104046642A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K19/00;C12R1/84
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本發明公開了二聚體化促血小板生成素(TPO)模擬肽TMP二聯體?人血清白蛋白融合蛋白的構建及發酵。所述融合蛋白包含1個HSA和2個TPO模擬肽通過連接短肽及二聚體化結構域連接。本發明所提供的二聚體化促血小板生成素模擬肽TMP二聯體?人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的發酵策略能夠顯著提高目的蛋白的表達效率。

技術領域

本發明屬于基因工程制藥領域，特別是涉及一種在畢赤酵母中以誘導型方式表達和生產二聚體化融合蛋白的方法。

發明背景

畢赤酵母(Pichia pastoris)是應用最為廣泛的外源蛋白表達宿主菌，它是甲醇營養型酵母中的一種，能夠在以甲醇為唯一碳源的培養基中生長(熊向華，2006)。畢赤酵母是迄今最為成熟的外源蛋白表達系統之一，目前己有上百種外源蛋白基因在畢赤酵母中獲得表達。外源基因在畢赤酵母中的表達需要有幾個基本條件：一是需要有高效的啟動子和終止子；二是要有同源序列以便外源基因能夠有效地整合到畢赤酵母基因組中；三是要有高通量的篩選方法。另外，影響外源基因在畢赤酵母中表達的還有培養條件、密碼子的偏好性以及蛋白質的三級結構等。

目前應用最為廣泛的誘導型啟動子是畢赤酵母醇氧化酶(Alcohol Oxidase，AOX)啟動子，在畢赤酵母中，有兩個不同的基因可編碼醇氧化酶：分別是AOX1和AOX2，二者之間有97％的氨基酸序列同源性。在畢赤酵母細胞中，基因AOX1的表達對醇氧化酶活性起主要作用。甲醇代謝的第一步是甲醇氧化，生成甲醛和氫過氧化物。為避免細胞氫過氧化物中毒，甲醇代謝在過氧化物酶體中進行。AOX1基因的表達受到嚴格的調控，而且受到甲醇誘導可以達到很高的水平，典型的是當畢赤酵母細胞在含甲醇的培養基中生長時，AOX1表達產物可占細胞總可溶性蛋白的30％以上，而AOX2卻表達很低。

畢赤酵母作為外源蛋白表達系統有諸多優點，它屬于低等真核生物，兼具真核生物和原核生物的特點。畢赤酵母是單細胞生物，遺傳背景的研究相對透徹，其生理生化特性己較為清楚，對于它的基因工程操作相對于植物或動物細胞來說，更加簡便和快捷，同時，它作為真核生物又具備了原核生物所沒有的特性，如蛋白的翻譯后加工和修飾，包括二硫鍵的形成、糖基化和脂酰化等。對于有細胞毒性的外源重組蛋白，可以將它定位于畢赤酵母的過氧化物酶體中，既可以保證宿主細胞不被毒性蛋白所傷害，又可以防止蛋白酶對外源重組蛋白的降解。而對于胞外表達的蛋白來說，由于畢赤酵母本身的分泌蛋白很少，因此，利于外源重組蛋白的分離和純化。畢赤酵母菌株及其代謝產物對于任何哺乳動物均沒有毒性，而且它能夠進行高密度發酵，培養成本低廉，操作簡單，極適合于工業化的大規模發酵生產。

采用畢赤酵母作為表達載體發酵生產重組蛋白的技術現在較為成熟，發酵過程中通常使用了invitrogen公司的發酵策略《Pichia Fermentation Process Guidelines》，具體流程概括如下：

1增菌階段：無機鹽培養基，甘油作為碳源，流加氨水補充氮源，并調整pH至6.0左右。

2誘導表達階段：無機鹽培養，流加甲醇作為碳源，流加氨水作為氮源，并調整pH至6.0左右。

隨著該表達系統應用的逐漸廣泛，越來越多的不同種類的融合蛋白均被嘗試采用畢赤酵母系統進行誘導表達，但在發酵過程中，由于不同的外源基因整合入宿主菌染色體后引起菌體性質的改變造成工程菌培養特性具有較大的差異，因此采用傳統通用的發酵策略往往得不到理想的發酵效果。