[發明專利]牛源性肉制品分子鑒定試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201310082539.1
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN103421890A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 劉榜;孫亞奇;張慶德
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種牛肉源性肉制品的分子鑒定方法，包括PCR反應，其特征在于下列步驟：

1)采集牛源肉品試樣，于-20℃下保存備用；

2)利用苯酚-氯仿粗提法提取步驟1)所述牛源肉品的基因組DNA；

3)設計的特異引物PCR擴增牛TNFRSF10A基因片段，其引物序列如序列表SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3所示；

4)擴增得到牛TNFRSF10A基因的核苷酸序列，該序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示；

5)利用反應試劑和反應程序進行PCR反應，對PCR反應產物進行電泳檢測；

6)在上述PCR反應的同時，設置陰性對照、陽性對照；

7)對PCR擴增產物進行檢測和結果判定，若普通牛TNFRSF10A基因特異性序列得到擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致，判定為樣品中檢測出普通牛源性成分，若普通牛TNFRSF10A基因特異性序列未得到擴增，或擴增片段大小與預期片段大小不一致，判定為樣品中未檢測出牛TNFRSF10A基因即牛源性成分；

其中：

步驟5)所述的PCR反應的試劑如下：

反應總體積：20.0μL；

雙蒸水：11.4μL；

10×PCR緩沖液：2.0μL，室溫，pH8.3-9.0；延伸溫度72℃；

25mmol/L的氯化鎂溶液：2.0μL，終濃度為2.5mmol/L；

各2.5mmol/L的dNTPs混合溶液：1.6μL；

10μmol/L的SEQ?ID?NO：2所示的引物0.4μL，終濃度為0.2μmol/L；

10μmol/L的SEQ?ID?NO：3所示的引物0.4μL，終濃度為0.2μmol/L；

5U/μL的Taq?DNA聚合酶：0.2μL，終濃度為0.05U/μL；

20ng/μL的受檢樣品DNA模板：2.0μL，終濃度為2.0ng/μL；

步驟5)的PCR反應程序如下：

94℃預變性5min；94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，30次循環；

72℃延伸3min；

步驟6)所述的陰性對照為非牛屬動物水牛、綿羊或山羊，非?？撇溉閯游锶恕⒇i、小鼠的基因組DNA；

步驟6)所述的陽性對照為?？婆倨胀ㄅ！⒛膛?、肉牛、黃牛的基因組DNA。

2.適用于權利要求1所述方法的牛肉源性肉制品的PCR鑒定試劑盒，其特征包含下列試劑組合物：

dNTP；

25mmol/L的MgCl₂溶液；

10×PCR緩沖液；

各2.5mmol/L的Tag聚合酶；

陽性DNA模板；

陰性DNA模板；

SEQ?ID?NO：2所述的引物；

SEQ?ID?NO：3所述的引物，和

雙蒸水；

上述陽性DNA模板為?？婆倨胀ㄅ?、奶牛、肉牛、黃牛的基因組DNA；

陰性DNA模板為非牛屬動物水牛、綿羊或山羊，非?？撇溉閯游锶恕⒇i、小鼠的基因組DNA；

PCR反應程序如下：

94℃預變性5min；94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，30次循環；

72℃延伸3min。

3.如權利要求2所述的牛肉源性肉制品的PCR鑒定試劑盒，其特征還包含權利要求1所述方法的操作說明書。

4.權利要求2或3所述的試劑盒在檢測肉源性制品中的應用。