[發(fā)明專利]基因MRC-1中與豬抗藍(lán)耳病相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310082159.8
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN104046622A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李寧;陳志勝;任立明;胡曉湘
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及基因MRC-1中與豬抗藍(lán)耳病相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），俗稱“藍(lán)耳病”是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的，該病毒是巢狀病毒目動脈炎病毒科的一個成員，同屬的病毒還有馬動脈炎病毒，鼠乳酸脫氫酶酶病毒和猴出血熱病毒。該病主要引起豬的繁殖與呼吸癥狀，表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎和母豬流產(chǎn)木乃伊胎等，每年對全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2007年在中國爆發(fā)了一場高熱病，該病迅速在全國范圍擴(kuò)散，超過200萬頭豬被感染，40萬頭豬死亡，該病最后證實(shí)是由一種高致病性的藍(lán)耳病毒引起的。PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細(xì)胞，現(xiàn)在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干擾素應(yīng)答，體液免疫不能及時產(chǎn)生有效的中和抗體，而且會形成抗體依賴的病毒增強(qiáng)效應(yīng)，最終導(dǎo)致免疫抑制和持續(xù)感染，由于該病毒的突變率極高，傳統(tǒng)疫苗方法也不能有效控制該病，很多研究都致力于尋找RNAi，干擾素等新的方法來針對該病毒，用于彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。

由于不同的豬品種和個體的遺傳背景差異，對藍(lán)耳病的抗性也不同，研究表明在臨床癥狀和生理生化指標(biāo)上，通城豬、梅山豬等國內(nèi)豬品種相較于國外長白豬、大白豬等感染高致病性PRRSV后有較強(qiáng)的抗性。通過高通量測序的方法，對感染PRRSV前后長白豬和通城豬的組織做差異基因表達(dá)分析，某些免疫相關(guān)的基因表達(dá)量在感染前后兩個品種間有顯著的差異。另外，存在一些品種間的SNP位點(diǎn)，這些基因在宿主的免疫應(yīng)答中起到了很重要的作用，而且這些SNP位于基因的外顯子中，通過找出不同品種間PRRSV感染造成的基因表達(dá)差異，不僅可以研究PRRSV的感染機(jī)制，還可以找出抗性或易感相關(guān)的基因，通過對品種間的SNP進(jìn)行比較分析，從而篩選出抗性較強(qiáng)的豬。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供基因MRC-1中與豬抗藍(lán)耳病相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。

甘露糖受體（MRC-1）是一種位于巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞表面的C-型凝集素，它可以識別病原表面的甘露糖，激活補(bǔ)體途徑。該受體通過識別糖蛋白表面的碳水化合物參與許多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞互作，巨噬細(xì)胞吞噬等。。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)在兩個不同抗性的豬品種：長白豬（易感豬）、通城豬（抗病豬）之間的MRC-1基因外顯子中存在兩個品種間SNP位點(diǎn)，用常規(guī)分子生物學(xué)方法檢測這兩個位點(diǎn)的堿基類型，可以作為一種檢測抗病和易感豬的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種與豬抗藍(lán)耳病相關(guān)的SNP標(biāo)記，其位于豬的MRC-1基因上，所述SNP標(biāo)記的核苷酸序列如SEQID?NO.1所示，其中，該序列的146bp和153bp兩處堿基為T的待測豬為易感藍(lán)耳病豬品種，而該兩處堿基為C的待測豬為抗藍(lán)耳病豬品種。

本發(fā)明還提供用于檢測與豬抗藍(lán)耳病相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物對，其包括上游引物F：5’-ATGCCAGACTCTGCCTGACT-3’和下游引物R：5'-TTCAGCAGCACTTTCAATGG-3'。

本發(fā)明還提供與豬抗藍(lán)耳病相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定抗藍(lán)耳病豬品種中的應(yīng)用，其包括步驟：1）提取待測豬樣品組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；2）以步驟1）中的cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；3）分析PCR產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中146bp和153bp兩處的堿基為C，則待測豬為抗藍(lán)耳病豬品種。

反轉(zhuǎn)錄PCR的步驟為：

i）打開RNA二級結(jié)構(gòu)

在一支無核酸酶污染的小離心管中加入：

RNA??????????????????2μg

oligodT??????????????1μg

無核酸酶水補(bǔ)齊至?????15μl

加熱離心管至70℃，5分鐘。

ii）反轉(zhuǎn)錄PCR

向上述離心管中加入：

反轉(zhuǎn)錄PCR的反應(yīng)條件為：42℃，60min。

常規(guī)PCR使用的擴(kuò)增體系以15μl計(jì)為：

常規(guī)PCR的反應(yīng)條件為：：95℃5min；以95℃30s，50℃-70℃，30s-2min；72℃30s-2min做35個循環(huán)；72℃10min，于4℃保溫。。

本發(fā)明還提供含有引物F和R的用于檢測抗藍(lán)耳病豬品種的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。