[發明專利]曲妥珠單抗突變體IgG及其應用

有效

• 申請號: 201310081620.8
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN104045714B
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 張劍冰;武術;楊帥
• 申請（專利權）人: 南京金斯瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/13;C12N15/85;C12N5/10;A61K39/395;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 夏平;傅婷婷

本發明屬于基因工程及免疫技術領域，公開了曲妥珠單抗突變體IgG及其應用。本發明通過對曲妥珠單抗重鏈編碼DNA進行點突變，獲得8個曲妥珠單抗IgG突變體，其重鏈的編碼DNA序列選自SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.9中的任意一條。本發明曲妥珠單抗各個突變體瞬時表達得到的蛋白純化產率同曲妥珠單抗均很高。各突變體IgG可以在不影響IgG產率和熱穩定性的前提下對曲妥珠單抗的ADCC效應有不同程度的提高，同曲妥珠單抗一樣，可在制備抗癌藥物中應用。

技術領域

本發明屬于基因工程及免疫技術領域，涉及曲妥珠單抗突變體IgG及其應用。

背景技術

自OKT3的作為抗體藥物在1986年的第一次面市，抗體藥物開發在過去的25年中取得了不可思議的進步。在2010年的十種最暢銷的藥物中有五個(Humira，Remicade，Enbrel,Rituxan和Avastin)是抗體藥物或Fc融合蛋白。

Her2是EGFR家族的成員之一并被發現在25-30%的乳腺癌病人中有高表達[1]，據此Her2被認為是針對乳腺癌進行靶向治療的重要靶點。1990年，Genentech的Fendly等從一系列鼠單抗中分離到單克隆抗體4D5，并發現這個抗體結合Her2的胞外域，抑制有Her2超表達的腫瘤細胞的生長[2]。4D5于1992年被人源化，人源化后的抗體被命名為Trastuzumab[3]，商品名為Herceptin。Herceptin于1998年被FDA批準作為和Taxol（paclitaxel）聯合用藥治療Her2高表達的轉移性乳腺癌的一線藥物。Herceptin還被批準用于經過一輪或多輪化療后的轉移性乳腺癌。在胃腸道癌癥治療方面，Herceptin還被批準和化療藥物一起治療胃和胃食管結合區的Her2高表達的擴散性腫瘤（http://www.herceptin.com/breast）。

Herceptin的作用機理被認為包括如下幾個方面：1）Herceptin可以通過加速受體的內吞作用和降解而降低細胞表面Her2的水平[4]，Herceptin還可以通過誘導p27/Cdk2復合物的形成抑制細胞周期的進展[5,6]。Herceptin的第三種作用機制為誘導抗體介導的細胞毒作用（ADCC），這一作用是通過Herceptin的Fc段和骨髓細胞表面抗體受體的FcγRIII和FcγRIIB調控的[5,7]。除此之外Herceptin還被認為有抑制腫瘤新血管形成[8]和腫瘤擴散[5]的作用。在這些作用機制中，誘導ADCC被認為在Herceptin的功效中起著重要的作用。

改變氨基酸序列可以被用來提高抗體誘導ADCC的能力。人IgG受體家族包含三個成員FcγRI（CD64），FcγRII(CD32)和FcγRIII（CD16）。IgG和不同的抗體受體結合可以帶來截然不同的反應。和激活性抗體受體的結合FcγRI，FcγRIIA，FcγRIIIA結合會帶來激活反應，導致對目標細胞細胞毒性的發生。和抑制性抗體受體，主要為FcγRIIB，結合會帶來抑制反應，抑制對目標細胞細胞毒性的發生[9]（Ravetch，Annual review ofimmunology2001）。

通過一個文庫的篩選，Stavenhagen等獲得了對FcγRIIIA和FcγIIA的結合能力有顯著提高的Fc突變體，這些突變體包括F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L，F243L/R292P/Y300L/P396L，F243L/R292P,/Y300L。這些突變體在體外ADCC實驗中顯示出比野生型Fc明顯提高的誘導ADCC的能力。在動物實驗中這些Fc突變體顯示出在低濃度下優于野生型抗體的抑制腫瘤生長的能力[10]。

通過ELISA和AlphaScreen測試，Anderson等篩選了對抑制性抗體受體FcγRIIB結合力下降或對激活性抗體受體FcγRIIIA結合力上升的Fc突變體。這些變異的一部分在體外實驗中顯示出比野生型含野生型Fc的抗體約高出10倍的誘導ADCC的能力[11]。