[發明專利]壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量的檢測方法

有效

• 申請號: 201310081254.6
• 申請日: 2013-03-13
• 公開（公告）號: CN103207256A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 李薇;陳娟娟;陳海敏;嚴小軍;徐繼林;楊銳
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛

技術領域

本發明涉及一種海洋生物有效成分的定量檢測方法，具體指一種壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量的方法。

背景技術

紅藻糖苷，英文名為O-α-D-galactopyranosylglycerol，其分子式為C₉H₁₈O₈，分子量為254，是一類半乳糖甘油類糖苷異構體，目前存在三種異構形式，分別為紅藻糖苷(α-D-半乳糖基-(1→2)-D-甘油,floridoside)、D型異紅藻糖苷(α-D-半乳糖基-(1→1)-D-甘油,D-isofloridoside)和L型異紅藻糖苷(α-D-半乳糖基-(1→1)-L-D-甘油,L-isofloridoside)。

紅藻中一般缺少大多數光合自養生物累積的游離單糖和寡糖，而以一種特殊的低分子紅藻苷糖游離狀態存在。上個世紀初，Kylin首次報道分離出這種糖苷類物質，此后Colin等證明其結構為α-氧-甘油-D-半乳吡喃糖苷。依據Majak等和Cra]gie等報道，在以紅藻為材料的放射性同位素標記試驗中，紅藻糖苷標記得快，標記量大，說明紅藻糖苷是紅藻重要的光合同化產物，所以分析紅藻中的紅藻糖苷，對于研究紅藻的光合作用、碳代謝及其它生理生化過程具有重要意義。此外，Reed和Kasten等報道了紅藻糖苷在調節滲透壓方面重要作用，特別在高滲條件下，這類糖苷的濃度會急劇增加。另外Kirst等經過多年研究發現大多數紅藻中都含有紅藻糖苷，并起到調節滲透壓的作用，除了仙菜目（海人草素起類似作用）。紫菜是我國最重要的經濟海藻之一，近年來隨著全球氣候變暖等自然和人為因素的影響，致使紫菜幼苗爛苗或成菜爛菜、減產，嚴重威脅著紫菜養殖業的持續發展。因此為適應我國海藻，特別是紫菜的生理和生態研究發展，建立紅藻糖苷的分析方法是十分必要的。

目前關于這種紅藻糖苷和異紅藻糖苷的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和氣相色譜質譜聯用法（GC-MS）。Colin等利用液相色譜研究在不同鹽度培養條件下魴生蜈蚣藻中的紅藻糖苷含量變化情況。范曉等利用衍生氣相色譜法對龍須菜中紅藻糖苷進行定性定量研究。Reed等采用GC-MS和核磁共振(NMR)方法分析鑒定了紅藻中的紅藻糖苷的結構。上述方法不僅檢測時間長，而且樣品檢測前處理步驟復雜。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀提供一種樣品進行處理簡單且檢測用時短的檢測壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷的方法，其利用液相色譜-三重四級桿串聯質譜聯用技術選擇反應監測模式（HPLC-QqQ-SRM-MS），對壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷能夠操作簡便、快速且靈敏度高的進行定量檢測。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：該利用液質聯用方法檢測壇紫菜中紅藻糖苷含量的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（一）、樣品處理過程：

取1g壇紫菜粉和4～6ml純度為65～75wt%的乙醇于反應瓶中，用鋁箔紙封口；置于水浴搖床，在110～130轉/分、65～75℃下水浴5～7小時，取出；

過濾得到的固相用熱乙醇（60～70℃）沖洗2～4次，每次10～20mL；

過濾所得沖洗液，過濾得到的液相在4500～5500轉/分下離心8～12分鐘，取液相置于燒瓶中，旋轉蒸干后，用0.4～06ml乙腈和0.4～06ml水溶解，得到的溶液用0.40～0.50μm濾膜過濾，得到的液相部分即為待測樣品。

（二）、檢測：

液相色譜和質譜條件：

（1）所用儀器：TSQ?Quantum?Access液相色譜-三重四極桿質譜聯用分析系統；

（2）液相條件：固定相為Waters?XBridgeTM?Amide柱（100mm×3.0mm,3.5μm）；流動相為體積比為90：10的乙腈-0.1%乙酸銨水溶液等度洗脫；進樣量10μL，柱溫40℃；

（3）質譜條件：采用電噴霧電離源負離子電離模式，噴霧電壓2.5KV，鞘氣流量25L/min，輔助氣流量5L/min，離子傳輸毛細管溫度350℃，掃描采用選擇反應監測SRM模式，母離子為[M-H]-離子m/z277，子離子m/z119和89，碰撞能量分別為20eV和21eV，采集時間均為0.2s，碰撞氣采用氬氣，碰撞氣壓力1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均設定為半峰寬0.7Da；

（三）、標準曲線繪制：

標準曲線的繪制可以使用現有技術中的任意一種方法，較好的，可以采用下述方法：