[發明專利]枯草芽孢桿菌PTS-394的發酵培養方法

有效

• 申請號: 201310081080.3
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN103146613A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 劉郵洲;喬俊卿;陳志誼;王治林
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 孫忠浩

技術領域

本發明涉及一種枯草芽孢桿菌PTS-394的發酵培養方法，尤其是一種利用Plackett-Burman法和響應曲面法優化發酵培養基及培養條件后實現對枯草芽孢桿菌PTS-394的培養方法。

背景技術

隨著種植業結構的調整，設施蔬菜種植面積逐年增加，高產、連作的設施蔬菜種植布局為病蟲害提供了充裕的營養和繁殖條件。近年來設施茄果類蔬菜土傳病害（青枯病、疫病、根結線蟲等）頻繁暴發。青枯病是一種毀滅性土傳細菌病害，發病初期地上部分雖表現為萎垂但葉片仍保持綠色，故名“青枯”。青枯病是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴重的植物病害之一，被稱為植物的“癌癥”。在我國主要農作物中以番茄、辣椒等茄科植物受青枯病的危害最為嚴重。一般田塊的發病率為10%-15%，重病田的發病率高達80%-100%。

目前，生產上防治設施茄果類蔬菜青枯病主要依靠化學農藥。這不僅造成生態環境嚴重污染，而且直接增加蔬菜中有毒化學物質的殘留，對人類健康帶來嚴重危害。為了解決蔬菜產量和質量之間矛盾，達到防治植物病害、減少化學農藥的使用量的目的，使用生物防治控制植物病害的方法越來越受到各國政府和人民的關注。

江蘇省農科院植保所篩選獲得的、對茄果類蔬菜青枯病有很好防效的枯草芽孢桿菌PTS-394，并于2011年11月1日申請了專利，公開號為CN102550607A。其中公開的形態特征記載為：菌株營養體為桿狀，兩端橢圓，周生鞭毛。大小為(?0.7-0.8)微米×(2.0-3.0)微米。無莢膜。芽孢中生，橢圓形，大小為(?0.6-0.9)微米×(1.0-1.5)微米。枯草芽孢桿菌PTS-394在牛肉汁蛋白胨瓊脂平板上培養時，菌落邊緣波浪形，米色，表面有皺褶。質地為不透明狀，不產生色素。革蘭氏反應陽性。H₂O₂酶反應陽性，V.P.?反應陽性。L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇利用為陽性。淀粉水解、明膠液化、檸檬酸鈉利用、二羥基丙酮形成反應也均為陽性。此外，枯草芽孢桿菌PTS-394還具有許多優良性能，如：有較廣的抑菌譜，對多種植物病原菌有很強的抑制作用；生長速度快，適應環境能力強，能在土壤和植物表面定殖，并形成優勢種群；誘導寄主產生抗病性；分泌產生多種抗菌物質。目前，江蘇省揚州市綠源生物有限公司已生產了200億枯草芽孢桿菌PTS-394活菌水劑。

枯草芽孢桿菌PTS-394活菌制劑中的菌含量是產品的一個重要技術和經濟指標。要提高發酵液中菌含量，就必須對其發酵培養基成分及配比、培養條件各個參數進行優化。

近年來，研究人員利用Plackett-Burman(PB)實驗設計方法可以快速從影響因素中篩選出對目標值影響最大的關鍵因子，并能為爬坡實驗指出方向和變化步長，已廣泛應用于微生物發酵培養基成分和工藝參數的篩選。響應曲面法（Response?Surface?Method，RSM）是一種適用性強且簡易可靠的統計學實驗設計優化方法，是一種優化生物過程的綜合技術。國內已有許多關于采用響應曲面法對微生物發酵過程進行優化的報道。

目前，利用Plackett-Burman法和響應曲面法優化獲得的以提高枯草芽孢桿菌PTS-394發酵菌液中活菌量為目的的發酵培養基和培養條件，未見諸報道。

發明內容

本發明的目的在于：針對目前枯草芽孢桿菌PTS-394活菌制劑中的菌含量較低的實際問題，提供一種基于傳統的枯草芽孢桿菌PTS-394發酵培養方法，對其中的發酵培養基和培養條件進行優化，提高發酵液中菌含量。

本發明的目的是這樣實現的：一種枯草芽孢桿菌PTS-394的發酵培養方法，包括在發酵培養基中接種枯草芽孢桿菌PTS-394種子液，在搖床上發酵培養2d，其特征在于：發酵培養基中的碳源為玉米淀粉，氮源為大豆粉，影響菌含量預測值的三個關鍵因子為玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在發酵培養基中的三個關鍵因子含量依次為11.48?g/L、13.35?g/L和0.90?g/L，發酵培養條件中影響菌含量和抑菌圈直徑的三個關鍵因子為溫度、初始PH值和裝液量，它們在發酵培養過程中選擇：溫度30.84℃，初始PH?6.93，裝液量65.15?mL/250?mL。。