[發(fā)明專利]旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B重組蛋白抗原及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310080980.6
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN103114095A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張西臣;李建華;徐曉芳;宮鵬濤;高江明;楊舉;李赫;張楠;張國才
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70;C07K14/435;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

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技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明提供了一種旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B重組蛋白抗原及其制備方法，涉及旋毛蟲與H7402肝癌相關(guān)抗原基因AN1型鋅指蛋白-2B抗體，本發(fā)明還提供了該抗體的醫(yī)用用途，屬于生物制藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

旋毛蟲是一種毛尾目，毛形科的旋毛形線蟲(Trihinella?spiralis），可感染包括人在內(nèi)幾乎所有哺乳動物，是一種危害較嚴(yán)重的人獸共患病。最近研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲感染可提高宿主對腫瘤的抵抗力，但對其抗腫瘤活性成分尚不清楚。據(jù)報(bào)導(dǎo)異體抗原物所產(chǎn)生的抗體及免疫細(xì)胞對惡性腫瘤具有抵抗作用。旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞間相關(guān)抗原產(chǎn)生的抗體可針對腫瘤細(xì)胞引發(fā)較強(qiáng)的特異性和非特異性免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供了一種旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B基因（以下簡稱：旋毛蟲AN1基因），為旋毛蟲與H7402肝癌相關(guān)抗原基因，是一種新的蛋白基因物質(zhì)，其抗體具有抗腫瘤生物活性。

本發(fā)明提供了旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B基因的制備方法。

本發(fā)明提供了旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B基因重組蛋白抗原。

本發(fā)明還提供了旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B基因重組蛋白抗原的制備方法，用于制備治療腫瘤的藥物。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B基因重組蛋白抗原的抗體在制備抗肝癌藥物中的用途。

本發(fā)明公開旋毛蟲AN1基因，基因序列如SEQ?no.1所示。

本發(fā)明用于擴(kuò)增旋毛蟲AN1基因的擴(kuò)增引物，具有以下序列：

上游引物??CGCGAATTCATGGAATTTCCTAATTTAGA???EcoRⅠ

下游引物??CCGCTCGAGTCAAGATATAAGGCAGTTTC?????XhoⅠ。

本發(fā)明所述旋毛蟲AN1基因的獲取方法如下：

分別制備旋毛蟲和H7402肝癌細(xì)胞的抗血清,利用間接ELISA方法確定H7402肝癌細(xì)胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與H7402肝癌細(xì)胞陽性血清間存在相關(guān)抗原；利用western?blotting方法確定H7402肝癌細(xì)胞抗原和旋毛蟲抗血清間具有交叉反應(yīng)的分子大小，利用H7402肝癌高免血清對旋毛蟲cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行免疫篩選獲得與H7402肝癌相關(guān)的抗原蛋白基因。設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR擴(kuò)增目的基因。

本發(fā)明公開的旋毛蟲AN1重組蛋白抗原，其特征在于：

利用分子量和等電點(diǎn)推測軟件得到，旋毛蟲AN1基因蛋白分子量約為24.1KD,等電點(diǎn)約為7.82。應(yīng)用DNAStar軟件對公開的旋毛蟲AN1蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測,該蛋白存在六個潛在的抗原表位，區(qū)域?yàn)椋?3-77，81-90，129-144，160-170，174-180，191-218。

本發(fā)明所述的旋毛蟲AN1重組蛋白抗原的制備方法，包括以下步驟：

將PCR產(chǎn)物與pMD-18T連接，雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-AN1和表達(dá)載體pET-28a(+)，回收并連接旋毛蟲AN1基因片段和pET-28a(+)載體片段，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top?10中。挑取陽性菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

本發(fā)明所述的旋毛蟲AN1重組蛋白抗原的抗體的制備方法，包括以下步驟：

用純化復(fù)性的原核表達(dá)蛋白免疫小鼠,獲得相關(guān)抗原基因蛋白的抗體血清。旋毛蟲與H7402肝癌細(xì)胞相關(guān)抗原蛋白抗體能對H7402肝癌產(chǎn)生強(qiáng)的抑制作用,且獲得的旋毛蟲與H7402肝癌細(xì)胞相關(guān)抗原蛋白抗體易于制備和工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明旋毛蟲AN1重組蛋白抗原的抗體在制備抗肝癌藥物中的用途。

本發(fā)明的積極效果在于：提供了旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B基因，并提供了該基因抗體的制備方法，分別制備旋毛蟲和H7402肝癌細(xì)胞的抗血清,利用間接ELISA方法確定H7402肝癌細(xì)胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與H7402肝癌細(xì)胞陽性血清間存在相關(guān)抗原；利用多克隆抗體從旋毛蟲cDNA文庫中免疫篩選獲得與H7402肝癌相關(guān)的抗原蛋白基因?？寺〔⒃吮磉_(dá)相關(guān)蛋白，純化復(fù)性其原核表達(dá)蛋白作為免疫原免疫小鼠，獲得相關(guān)抗原基因蛋白的抗體。旋毛蟲AN1重組蛋白抗原的抗體能對H7402肝癌產(chǎn)生強(qiáng)的抑制作用,且獲得的旋毛蟲AN1重組蛋白抗原的抗體易于制備和工業(yè)化生產(chǎn)。