[發明專利]一種環丁烷嘧啶二聚體光修復酶脂質體的制備方法

有效

• 申請號: 201310080376.3
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN103212066A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 曹毅;喬代蓉;徐輝
• 申請（專利權）人: 曹毅;喬代蓉;徐輝
• 主分類號: A61K38/51
• 分類號: A61K38/51;A61K9/127;C12N15/60;C12N15/70;C12N9/88;A61P17/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種環丁烷嘧啶二聚體光修復酶脂質體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、環丁烷嘧啶二聚體光修復酶的表達：從生物體中克隆到環丁烷嘧啶二聚體光修復酶基因，將該基因構建到原核表達載體p?GEX4T-1中，再轉化至大腸桿菌表達菌株E.coliBL21感受態細胞，得到菌液；在3～50ml含氨芐青霉素的LB培養基中加入LB培養基體積1～5％的菌液，37℃培養至OD₆₀₀為0.6～0.8；再加入IPTG至終濃度為0.1～0.8mol/L，23～28℃誘導表達3～4h，在10000～12000個重力加速度條件下離心沉淀菌體，收集菌體，將菌體進行超聲波破碎，破碎后的菌體液于10000～12000個重力加速度條件下離心去除菌體碎片，收集離心分離出的上清液，得到環丁烷嘧啶二聚體光修復酶粗品；其中，超聲波破碎的條件為：在200～400W的功率下，工作時間1～5s，間歇時間2-5s，超聲破碎20-40min；

b、環丁烷嘧啶二聚體光修復酶的純化：將步驟a制得的環丁烷嘧啶二聚體光修復酶粗品以100～150ml/h的流速加入到谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱內，用5～10倍柱床體積的洗脫液A以200～400ml/h的流速進行淋洗，再以5～10倍柱床體積的洗脫液A和洗脫液B進行梯度洗脫，得到融合環丁烷嘧啶二聚體光修復酶；再按照1-5U/mg蛋白質的用量，將凝血酶加入到融合環丁烷嘧啶二聚體光修復酶中，37℃酶解1～3h，切除谷胱甘肽-S-轉移酶，得到酶切水解液；將酶切水解液以100～150ml/h的流速加入到Q柱中，用5～10倍柱床體積的洗脫液C以200～400ml/h的流速進行淋洗，再以5～10倍柱床體積的洗脫液C和洗脫液D進行梯度洗脫，得到環丁烷嘧啶二聚體光修復酶；再將環丁烷嘧啶二聚體光修復酶進行脫鹽柱脫鹽處理，得到高純度的環丁烷嘧啶二聚體光修復酶；

其中，洗脫液A由50mM?Tris/HCl和0.15MNaCl組成；洗脫液B由50mMTris/HCl和10mMGSH組成；洗脫液C由10mM?PB和0.15MNaCl組成；洗脫液D由10mM?PB和1MNaCl組成；

c、環丁烷嘧啶二聚體光修復酶脂質體的制備：稱取50～100mg卵磷脂和20～50mg膽固醇，溶解于7.5～15ml乙醚中，加入0.1～0.5mg步驟b制得的高純度環丁烷嘧啶二聚體光修復酶，再進行超聲乳化，形成油包水，再進行蒸餾去除低沸點有機相，得到環丁烷嘧啶二聚體光修復酶脂質體混懸液；再繼續蒸發，直至白色懸液形成；將白色懸液以15000-20000r/min離心30～40min，收集沉淀，冷凍保存，制得環丁烷嘧啶二聚體光修復酶脂質體。

2.根據權利要求1所述的環丁烷嘧啶二聚體光修復酶脂質體的制備方法，其特征在于：所述生物體為杜氏鹽藻。

3.根據權利要求1所述的環丁烷嘧啶二聚體光修復酶脂質體的制備方法，其特征在于：步驟c中，超聲乳化的條件為：在100～300W的功率下，工作時間1～3s，間歇時間2-5s，超聲時間為20-30min。