[發(fā)明專利]便利連接基因的植物表達載體及其構建方法與應用無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310079351.1 | 申請日： | 2013-03-13 |
| 公開（公告）號： | CN103173486A | 公開（公告）日： | 2013-06-26 |
| 發(fā)明（設計）人： | 季靜;王罡;吳疆;刁進進 | 申請（專利權）人： | 天津大學 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;C12N15/66;C12N1/21;A01H5/00 |
| 代理公司： | 天津市杰盈專利代理有限公司 12207 | 代理人： | 王小靜 |
| 地址： | 300072*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 便利 連接 基因 植物 表達 載體 及其 構建 方法 應用 | ||
1.一種植物表達載體，其特征在于按照包括如下步驟的方法得到：出發(fā)表達載體為pGreenII0229和pCAMBIA3300-35S-HAK，分別用引物從pGreenII0229上克隆兩個片段，分別含有LB和RB，且在這兩個片段上含有了大腸桿菌中的復制元件；從pCAMBIA3300-35S-HAK上克隆35S-NOS片段；從pGH-X6145G上克隆多克隆位點片段為4#片段；從pCAMBIA2300上克隆35S片段，最后將這5個片段連接在一起，構建成新的植物表達載體pJWWD-1718；
其中，RB位于從pGreenII0229克隆的1#片段5’端下游，LB位于從pGreenII0229克隆的2#片段中部；
其中，所述1#片段如序列SEQ?ID?NO：1所示，所述2#片段如序列SEQ?ID?NO：2所示，所述3#片段如序列SEQ?ID?NO：3所示，5#片段如序列SEQ?ID?NO：9所示；
其中，所述RB如序列SEQ?ID?NO：4所示，所述LB如序列SEQ?ID?NO：5所示，所述凝血酶基因如序列SEQ?ID?NO：6所示，所述大豆蛋白肽基因如序列SEQ?ID?NO：7所示。
2.一種植物表達載體，其特征在于按照包括如下步驟的方法得到：
（1）用1#F引物和1#R引物克隆pGreenII0229的1#片段，兩端分別帶有Not?I和MIU?I的酶切位點，切膠回收2kb片段；用2#F引物和2#R引物克隆pGreenII0229的2#片段，兩端也分別帶有Not?I和MIU?I的酶切位點，切膠回收1600b片段；
（2）用Not?I和MIU?I酶切回收的1#和2#片段，連接這兩個片段，得到載體pJWWD-12；
（3）用3#F引物和3#R引物克隆pCAMBIA3300-35S-HAK上的3#片段，切膠回收3#片段，兩端帶有Xho?I酶切位點；
（4）用Xho?I分別酶切pJWW-12和3#片段，連接切開的載體和3#片段，得到載體pJWWD-123；
（5）用4#F引物和4#R引物從pGH-X6145G克隆4#片段，其中含有多克隆位點，切膠回收300bp片段；
（6）用Sac?I分別酶切載體pJWWD-123和4#片段，連接切開的載體和4#片段，得到載體pJWWD-1234；
（7）從pCAMBIA2300上克隆35S啟動子（5#片段），切膠回收800bp片段；
（8）用Pst?I分別酶切載體pJWWD-1234和5#片段并回收，連接切開的載體和5#片段得到載體pJWWD-1718。
3.權利要求1或2所述的表達載體在大腸桿菌轉化中的應用。
4.權利要求1或2所述的表達載體在農桿菌介導的植物遺傳轉化中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：所述植物為單子葉和雙子葉植物，包括：水稻、玉米、大麥、小麥、高粱、甘蔗、美人蕉、白玉蘭、大豆、花生、蘋果、菊花、棉花、向日葵。
6.權利要求1或2所述表達載體在植物育種中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述的植物為單子葉和雙子葉植物，包括：水稻、玉米、大麥、小麥、高粱、甘蔗、美人蕉、白玉蘭、大豆、花生、蘋果、菊花、棉花、向日葵。
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