[發明專利]生產γ-聚谷氨酸的重組谷氨酸棒桿菌及構建方法和用途

有效

• 申請號: 201310079151.6
• 申請日: 2013-03-13
• 公開（公告）號: CN103146630A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 姚文娟;孟國梁;張偉;陳向凡;殷潤婷
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P13/02;C12R1/15;C12R1/125
• 代理公司: 南通市永通專利事務所 32100
• 代理人: 葛雷

1.一種生產γ-聚谷氨酸的重組谷氨酸棒桿菌，其特征是：是以野生型C.glutamicum?ATCC13869為出發菌株，轉入含有γ-PGA合成酶復合體基因pgsBCA的重組表達質粒獲得的工程菌。

2.一種權利要求1所述的生產γ-聚谷氨酸的重組谷氨酸棒桿菌的構建方法，其特征是：包括下列步驟：（1）構建含有γ-PGA合成酶基因pgsB、pgsC和pgsA的重組表達質粒；所述重組表達質粒是將pgsBCA基因插入E.coli/和C.glutamicum穿梭載體pEKEx2，得到的重組質粒pEKEx2－BCA；（2）將步驟（1）構建的重組表達質粒轉化入C.glutamicum?ATCC13869中。

3.根據權利要求2所述的生產γ-聚谷氨酸的重組谷氨酸棒桿菌的構建方法，其特征是：步驟（1）的具體方法是：以枯草芽孢桿菌TKPG011基因組作為PCR模板，設計引物分別擴增pgsB、pgsC和pgsA，將pgsB片段兩端分別接上BamHI和HindⅢ位點，引物為：正義鏈：5’-gttgttggatccatgtggttactcattatagcctgtg-3’，反義鏈：5’-gttgttaagcttcatgcttacgagctgcttaacc-3’，PCR擴增參數如下：95℃30s,54℃50s,72℃1min30s,共30個循環；將pgsC片段兩端分別接上HindⅢ和NdeI位點，引物為：正義鏈：5’-gttgttaagcttctagatgttcggatcag-3’，反義鏈：5’-gttgttcatatgcattaaattaagtggtaaac-3’，PCR擴增參數如下：95℃30s,56℃40s,72℃1min,共30個循環；將pgsA片段兩端分別接上NdeI和XbaI位點，引物為：正義鏈：5’-gttgttcatatgaagaaggaactgagctttc-3’，反義鏈：5’-gttgtgtctagattatttagattttagtttgtcactatgatc-3’，PCR擴增參數如下：95℃30s,51℃50s,72℃1min30s,共30個循環；將pgsB、pgsC和pgsA片段分別酶切裝入載體pEKEx2中，形成pgsBCA融合片段。

4.根據權利要求2所述的生產γ-聚谷氨酸的重組谷氨酸棒桿菌的構建方法，其特征是：步驟（2）的具體方法是：谷氨酸棒桿菌感受態的制備：挑取新鮮平皿上谷氨酸棒桿菌C.glutamicum?ATCC13869，接種入含0.5%質量體積比的葡萄糖的2ml液體LB培養基中，30℃，200r/min培養12小時，再按接種量與培養基的體積百分比為1%接種到含質量體積比為3%的甘氨酸和體積比為0.1%的Tween80的50ml?LB中，使起始OD₆₀₀達到0.4，在30℃中繼續培養至OD₆₀₀達到0.9；將菌液冰浴20分鐘，離心收集菌體，用預冷的體積百分比10%的甘油重懸細胞，用1.5ml離心管分裝，每管80μl，得谷氨酸棒桿菌C.glutamicum?ATCC13869感受態細胞；將谷氨酸棒桿菌C.glutamicum?ATCC13869感受態細胞放-70℃冰箱保存或直接用于電擊轉化；

電擊轉化重組質粒pEKEx2－BCA：在1.8kv,5ms條件下使用電擊儀將質粒pEKEx2－BCA轉化入谷氨酸棒桿菌C.glutamicum?ATCC13869感受態細胞中；在含有25μg/ml卡那霉素的固體LB培養基上篩選出陽性克隆，得到重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum?ATCC13869（pEKEx2－BCA）。

5.一種權利要求1所述的生產γ-聚谷氨酸的重組谷氨酸棒桿菌在γ-PGA生產中的應用。