[發明專利]用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物

有效

• 申請號: 201310079067.4
• 申請日: 2013-03-12
• 公開（公告）號: CN103243173A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 曹偉勝;劉雪美;廖明;徐成剛
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 楊曉松

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，特別涉及一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒（HEV）的LAMP引物。

背景技術

LAMP（Loop-Mediated?Isothermal?Amplification）技術是由Notomi等在2000年發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該方法采用特異地識別靶序列上六個區域的四條引物（兩條外引物，兩條內引物）及具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在60～65℃進行核酸的指數級擴增，其擴增效率可達到10⁹～10¹⁰個拷貝數量級；整個反應僅需50min，在擴增反應中副產物焦磷酸鎂沉淀與SYBR?GreenⅠ或鈣黃綠素結合，產生黃綠色熒光，不需要借助其他儀器便可辨別實驗結果。LAMP技術具有簡便、快速、準確、廉價、易檢測等特點。目前，國內外尚未見采用LAMP引物檢測HEV的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物，其核苷酸序列如下所示：

F3：5’GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’；

B3：5’TGAAGCAGTTCCAGTAGC3’；

FIP：5’CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’；

BIP：5’AGTGTTTTTGATTGTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3’。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

（1）本發明以4條精確設計的引物嚴格識別靶核苷酸序列上的6個獨立區域，從而避免反應混合物中存在的非靶序列的影響，特異性高。

（2）本發明的擴增模板量為100拷貝，比常規PCR檢測高1～2數量級，靈敏性比較高。

（3）本發明的LAMP不需通過溫度循環變化來擴增，免除變溫過程耗費的時間，使反應在30～60min就能將幾個拷貝的靶基因高效擴增，反應時間短。

（4）本發明的設備簡單，不需凝膠成像系統，只需一臺普通水浴鍋或者濁度儀，且檢測結果可肉眼直接觀察，易于判定。

附圖說明

圖1是實施例1的火雞出血性腸炎病毒的LAMP濁度檢測結果。

圖2是實施例1的火雞出血性腸炎病毒的LAMP可視化檢測結果；其中：A為SYBR?green?I的可視化檢測結果；B為鈣黃綠素可視化檢測結果；C為SYBR?green?I反應后在紫外燈下的熒光效應結果；“-”代表陰性反應，“+”代表陽性反應。

圖3是實施例2的酶切電泳鑒定LAMP反應產物的結果圖；其中：M為DNA分子質量標準DL2000的電泳鑒定結果圖；NC為陰性對照的電泳鑒定結果圖；1為HEV?LAMP陽性擴增產物的電泳鑒定結果圖；2為HEV?LAMP陽性擴增產物經Tsp45I酶切產物的電泳鑒定結果圖。

圖4是實施例3的不同濃度的火雞出血性腸炎病毒的LAMP濁度檢測結果；其中：A為10⁵拷貝/管的陽性質粒的LAMP濁度檢測結果；B為10⁴拷貝/管的陽性質粒的LAMP濁度檢測結果；C為10³拷貝/管的陽性質粒的LAMP濁度檢測結果；D為10²拷貝/管的陽性質粒的LAMP濁度檢測結果。