[發明專利]一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法

無效

• 申請號: 201310078921.5
• 申請日: 2013-03-13
• 公開（公告）號: CN104046681A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 余知和;曾昭清;周建芬;程云方
• 申請（專利權）人: 長江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/68
• 代理公司: 北京市中實友知識產權代理有限責任公司 11013
• 代理人: 熊成香

技術領域：

本發明涉及一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法，屬真菌分子生物檢測技術領域。

背景技術：

真菌存在于幾乎所有的陸地和水生生態系統中，與人類生產活動和生活關系密切。許多真菌具有重要的經濟意義，但也有些種類的真菌會引起植物、動物和人類的病害或產生毒素，會危害人類的健康。

煙曲霉菌（Aspergillus?fumigatus）是自然界中廣泛存在的腐生真菌，也是重要的機會致病菌。隨著免疫受損人群的增多，系統性曲霉病的90%是由煙曲霉菌引起的。同時，煙曲霉菌產生的毒素嚴重污染糧食與飼料制品，危害人和動物的健康，造成重大的經濟損失，煙曲霉菌已成為臨床醫學和醫學微生物家們關注的熱點。

煙曲霉菌的檢測技術經歷了傳統培養鑒別、層析法及色譜法等化學方法檢測、免疫學檢測、分子生物學檢測等。

近年來，隨著高效基因擴增平臺、引物設計方案以及定量擴增技術的發展和應用，包括真菌在內的微生物快速檢測與鑒定對于病害診斷、監測和防治具有重要意義。

發明內容：

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法，具有快速、準確、高效的特點。

本發明是通過如下技術方案來實現上述目的的。

本發明提供的一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法，包括如下步驟：

（1）提取待測煙曲霉菌株的總DNA；

（2）選取RPB2基因作為分子標記，即目的片段，設計特異性引物3條，分別為：

1)引物名稱F2255，引物序列CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG；

2)引物名稱R3044，引物序列TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT；

3)引物名稱R3438，引物序列CTGCCGGGTCAGAATCTGT；

（3）待測煙曲霉菌株目的片段PCR擴增；

（4）瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據電泳檢測結果判斷待測菌株是否為煙曲霉菌。

本發明與現有的技術相比具有如下有益效果：

本發明基于已公布的曲霉屬真菌煙曲霉、棒曲霉、費氏曲霉、黃曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和土曲霉等的基因組序列，通過基因組同源性分析，選擇RPB2基因作為研究對象，根據RPB2基因存在的12個保守區域的序列比對結果和變異位點，篩選出可用于煙曲霉快速鑒定的特異性引物。通過設計3條引物，對待測煙曲霉菌株的目的基因片段進行PCR擴增,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測方法判斷待測菌株是否為煙曲霉菌。

具體實施方式：

下面結合具體實施例，對本發明作進一步說明。

1、待測曲霉菌株的培養

待測曲霉菌樣品來源于中國科學院微生物研究所、北京大學真菌和真菌病研究中心、吉林大學真菌研究中心，接種至PDA培養基上，置培養箱28℃培養。

2、待測曲霉菌株的DNA提取

挑取直徑5mm的曲霉菌株菌絲塊接種至100ml?PD液體培養基中，室溫下搖床培養(250rpm)2--4周，收集菌體并用無菌生理鹽水沖洗數次，滅菌濾紙吸干。取0.1g菌體在液氮中迅速研磨成粉末，用2%(w/v)CTAB緩沖液抽提DNA，0.8%瓊脂糖凝膠檢測DNA樣品。

3、目的片段PCR擴增

PCR反應在ABI2720PCR儀(美國加州ABI公司)上進行，25μl反應體系包括：超純水17.5μl，10×buffer2.5μl，引物(10μM)各1μl，TaqDNA聚合酶(1.25U/μl)0.5μl，dNTP(2.5mM)1μl，模板DNA1μl。

PCR反應條件為：94°C預變性4min；94°C變性30s，66°C(或64°C)退火30s，72°C延伸45s，30個循環；72°C延伸7min。

引物列表：

4、瓊脂糖凝膠電泳檢測

擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物F2255-R3044和F2255-R3438的擴增產物分別約800bp和1200bp。

5、序列測定驗證

目的片段PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司，ABI3730XL測序儀雙向測序。

引物F2255/R3044擴增煙曲霉得到的序列為790bp：

CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC