[發明專利]減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310078783.0
• 申請日: 2008-09-19
• 公開（公告）號: CN103214562A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 王小剛;徐明愷;張惠文;劉昌孝;陳艷;陳巨余
• 申請（專利權）人: 沈陽協合集團有限公司
• 主分類號: C07K14/31
• 分類號: C07K14/31;C12N15/31;C12N15/70;A61K39/085;A61P35/00;A61P1/12;A61P1/08;C12R1/445
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

本申請是中國發明專利申請的分案申請，原申請的申請日：2008年9月19日，申請號：200810013284.2，發明創造名稱：減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法和應用，公開號：CN101560248A；在專利審查過程中，由于原申請中所涉及蛋白的氨基酸序列存在審查員指出的相似序列，申請人為得到更好的保護，現提出此分案申請。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體的說是一種減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

超抗原(superantigen，SAg)是一組由細菌或病毒編碼的，并在極低濃度下對人體或其他哺乳動物T淋巴細胞產生極強免疫刺激活性的蛋白質分子。不像傳統的抗原，超抗原不需要抗原遞呈細胞的加工處理，在抗原遞呈細胞外側的抗原結合區與MHC?II(組織相容性復合物)分子和T細胞Vβ區結合形成復合物，從而激發大量的T淋巴細胞增殖，進而導致在體外或體內釋放產生大量的細胞因子和其它效應分子。正因為超級抗原存在這種特殊的生物活性和作用機理，所以致使其可以作為一種臨床上的免疫調節劑和抗腫瘤藥物，用于表達MHC?II分子的腫瘤治療。

金黃色葡萄球菌腸毒素C2(Staphylococcal?enterotoxin?C2，SEC2)是一類具有代表性的微生物外毒素。由于其極強的T細胞激活功能，成為一類典型微生物超抗原，近年來受到人們的廣泛關注。但是，由于腸毒素C2超抗原的作用必須依賴于與免疫系統中的MHC?II分子相結合，這必然會導致其在人體中可能與來自正常組織或細胞的MHC?II分子的結合，從而對正常細胞也產生一定的毒性作用；此外，由于金黃色葡萄球菌腸毒素是一種細菌外毒素，因此在對人體會產生一定的毒素綜合癥(TSS)和食物中毒癥狀，并在臨床上表現為嘔吐、腹瀉、以及致熱等癥狀，因此限制了其臨床應用和治療可得效果。

因此，為減少腸毒素C2作為細菌外毒素所帶來的邊際效應和對人體的毒副作用，進而提高腸毒素C2在未來抗腫瘤方面的開發潛力，本發明通過基因定點突變技術對SEC2中與毒性相關的位點進行突變，從而達到減毒的目的。

發明內容

本發明目的在于提供一種減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法和應用。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：

減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白：所述減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白具有序列表SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:9、SEQ?ID?NO:11、SEQ?ID?NO:13或SEQ?ID?NO:15中堿基序列。

所述減毒腸毒素C2超抗原突變編碼蛋白具有序列表SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:8、SEQ?ID?NO:10、SEQ?ID?NO:12、SEQ?ID?NO:14或SEQ?ID?NO:16中氨基酸序列。

減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法：

以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和sec2(C93A)-R:5’-GATGAAAAATATG?CGTTTACATAG-3’;sec2(C93A)-F:5’-ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA-3’和sec2-R:5’-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT?GTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側和右側的重疊PCR產物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側和右側的重疊PCR產物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ?ID?NO:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因；

以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和sec2(D83A)-R:5’-TCCATACACAGCA?ACTACTTCATCT-3’;sec2(D83A)-F:5’-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT?CAAAT-3’和sec2-R:5’-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分別擴增獲得突變位點左側和右側的重疊PCR產物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點左側和右側的重疊PCR產物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ?ID?NO:3中堿基序列sec2(D83A)突變基因；