[發明專利]金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫制劑及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201310077984.9
• 申請日: 2013-03-12
• 公開（公告）號: CN103160519A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 張婉茹;張國利;張亮;朱平;田園;吳廣謀;岳玉環
• 申請（專利權）人: 張婉茹
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/62;C07K19/00;A61K39/085;A61P31/04;C12R1/445
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明涉及金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫制劑及其制備方法和藥物的用途。

背景技術

葡萄球菌可分為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。引起食物中毒的主要是金黃色葡萄球菌產生的腸毒素。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus）廣泛存在于空氣、土壤、水及物品。在人和家畜的體表及與外界相通的腔道，檢出率也相當高。葡萄球菌的抗原結構較復雜，細胞壁經水解后，用沉淀法可得到兩種抗原成分，即蛋白質抗原和多糖類抗原。蛋白質抗原主要為葡萄球菌A蛋白（Staphylococcus?protein?A,簡稱SPA），是一種表面抗原，從人分離到的菌株均有SPA，來自動物的少見。90%以上的金黃色葡萄球菌有此抗原，因而只具有種的特異性而無型的特異性。SPA的分子質量為13000-42000μ，它能與人及哺乳動物血清中IgG的Fc片斷發生非特異性結合。多糖類抗原為存在于細胞壁上的半抗原，是該菌的一個重要抗原，有型特異性。其抗原決定簇為磷壁酸中核糖醇單位，此抗原可用于該菌的分型。金黃色葡萄球菌采取噬菌體分型共分5個群。金黃色葡萄球菌在生長繁殖過程中還產生多種毒素和酶，其中主要有溶血毒素、腸毒素、殺白細胞素、血漿凝固酶、DNA酶、耐熱性核酸酶和透明質酸酶等。

在無芽孢的細菌中，葡萄球菌的抵抗力最強。在干燥的濃汁中可生存數月，濕熱80℃、

30min才能將其殺死。耐鹽性強，在含鹽7.5%-15%的培養基上能生長，但對燃料較敏感，如培養基中加入5×10^-6龍膽紫液可抑制其生長。對磺胺類藥物敏感性較低，紅霉素、鏈霉素、氯霉素及四環素較敏感。腸毒素的耐熱性強，食物中毒素煮沸120min方能破壞，故一般的消毒及烹調不能破壞。低溫下2個月以上失去毒力，可抵抗0.3%福爾馬林達48h，pH3-10不被破壞，但在0.915mg/L氯溶液中3min即可破壞。

金黃色葡萄球菌腸毒素B（Staphylococcal?entertoxin?B?SEB）是一種單體蛋白，它的分子質量是28366Da，等電點pI為8.6。對于每個蛋白質的一級結構和氨基酸序列是不一樣的。金黃色葡萄球菌腸毒素B的氨基酸數量是238。SEB毒素蛋白有大量的賴氨酸(13.4%)和天冬氨酸(10.1%)帶負電的殘基有36個(天冬氨酸+谷酰胺)帶正電的殘基(精氨酸+賴氨酸)是37個。SEB的原子數量是3922個,其與原子組成成分碳1269個,氫1932個,氮324個,氧387個,硫10個。一分子的SEB的三維結構包含兩個區域，這些區域是通過6個殘基延伸的loop連接；一區（30-120），二區（127-239）。一個長的α-螺旋跨過兩個區域的分子中心。區域一包含一個β-圓柱體（包含β1，β2，β3，β4，β5股）和三個螺旋（α2，α3，和α5）。

一區發現了大量的可溶性狂犬病殘基。通過不同的β回轉，β1與β2股和β2與β3兩個半胱氨酸殘基（半胱氨酸93和半胱氨酸113）在β圓柱體的上方形成一個的二硫化物鍵。兩個半胱氨酸殘基之間的序列形成一個能移動的、可溶的loop。

SEB的二區和其他微生物的超抗原是不一樣的。它包含逆向平行的β折疊（β6-β12股）包著處于中心的α螺旋，β6股逆向平行β7，β7平行β12；β9逆向平行β12和β10。最近有關報道了二區可能結合p85蛋白質。N端尾部（殘基1到20）在二區的表面。殘基14到17?在二區的頂部形成一個310-螺旋回轉（作為α1螺旋被標記）。葡萄球菌核酸中發現了OB-折疊，并在一些毒素和無關序列的非毒素蛋白質中出現。在蛋白質進化的過程中關于OB-折疊提出了很多觀點。OB折疊在超抗原進化過程中是否結合二氧化碳分子仍然沒有闡明。盡管這樣，一個半乳糖類似物即半乳糖神經酰胺（半乳糖α1-4半乳糖β1-1神經酰氨）已經被證明作為SEB受體起到重要作用。SEB結合MHC??的親和力很高（K_d-10^-6），它能結合小鼠的T細胞Vβ3，7，8.1，8.1，8.3，和17。根據SEB的拓撲異構和突變研究，T-細胞受體結合部位被SEB區域1和區域2形成的淺槽包圍。SEB分子中α5螺旋，面對著結合MHC??分子的鄰近位點。

SEB是一種熱穩定蛋白。由于最開始過快的加熱，在高溫條件下會造成SEB活性的減弱。當毒素在PH7.3，100℃，加熱5min，它的活性損失少于50%。SEB會抵抗變性劑的變性作用，比如尿素和鹽酸胍。