[發(fā)明專利]金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫制劑及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310077984.9
• 申請日: 2013-03-12
• 公開（公告）號: CN103160519A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張婉茹;張國利;張亮;朱平;田園;吳廣謀;岳玉環(huán)
• 申請（專利權(quán)）人: 張婉茹
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/62;C07K19/00;A61K39/085;A61P31/04;C12R1/445
• 代理公司: 長春市東師專利事務(wù)所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫制劑及其制備方法和藥物的用途。

背景技術(shù)

葡萄球菌可分為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。引起食物中毒的主要是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus）廣泛存在于空氣、土壤、水及物品。在人和家畜的體表及與外界相通的腔道，檢出率也相當(dāng)高。葡萄球菌的抗原結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，細(xì)胞壁經(jīng)水解后，用沉淀法可得到兩種抗原成分，即蛋白質(zhì)抗原和多糖類抗原。蛋白質(zhì)抗原主要為葡萄球菌A蛋白（Staphylococcus?protein?A,簡稱SPA），是一種表面抗原，從人分離到的菌株均有SPA，來自動物的少見。90%以上的金黃色葡萄球菌有此抗原，因而只具有種的特異性而無型的特異性。SPA的分子質(zhì)量為13000-42000μ，它能與人及哺乳動物血清中IgG的Fc片斷發(fā)生非特異性結(jié)合。多糖類抗原為存在于細(xì)胞壁上的半抗原，是該菌的一個重要抗原，有型特異性。其抗原決定簇為磷壁酸中核糖醇單位，此抗原可用于該菌的分型。金黃色葡萄球菌采取噬菌體分型共分5個群。金黃色葡萄球菌在生長繁殖過程中還產(chǎn)生多種毒素和酶，其中主要有溶血毒素、腸毒素、殺白細(xì)胞素、血漿凝固酶、DNA酶、耐熱性核酸酶和透明質(zhì)酸酶等。

在無芽孢的細(xì)菌中，葡萄球菌的抵抗力最強(qiáng)。在干燥的濃汁中可生存數(shù)月，濕熱80℃、

30min才能將其殺死。耐鹽性強(qiáng)，在含鹽7.5%-15%的培養(yǎng)基上能生長，但對燃料較敏感，如培養(yǎng)基中加入5×10^-6龍膽紫液可抑制其生長。對磺胺類藥物敏感性較低，紅霉素、鏈霉素、氯霉素及四環(huán)素較敏感。腸毒素的耐熱性強(qiáng)，食物中毒素煮沸120min方能破壞，故一般的消毒及烹調(diào)不能破壞。低溫下2個月以上失去毒力，可抵抗0.3%福爾馬林達(dá)48h，pH3-10不被破壞，但在0.915mg/L氯溶液中3min即可破壞。

金黃色葡萄球菌腸毒素B（Staphylococcal?entertoxin?B?SEB）是一種單體蛋白，它的分子質(zhì)量是28366Da，等電點(diǎn)pI為8.6。對于每個蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)和氨基酸序列是不一樣的。金黃色葡萄球菌腸毒素B的氨基酸數(shù)量是238。SEB毒素蛋白有大量的賴氨酸(13.4%)和天冬氨酸(10.1%)帶負(fù)電的殘基有36個(天冬氨酸+谷酰胺)帶正電的殘基(精氨酸+賴氨酸)是37個。SEB的原子數(shù)量是3922個,其與原子組成成分碳1269個,氫1932個,氮324個,氧387個,硫10個。一分子的SEB的三維結(jié)構(gòu)包含兩個區(qū)域，這些區(qū)域是通過6個殘基延伸的loop連接；一區(qū)（30-120），二區(qū)（127-239）。一個長的α-螺旋跨過兩個區(qū)域的分子中心。區(qū)域一包含一個β-圓柱體（包含β1，β2，β3，β4，β5股）和三個螺旋（α2，α3，和α5）。

一區(qū)發(fā)現(xiàn)了大量的可溶性狂犬病殘基。通過不同的β回轉(zhuǎn)，β1與β2股和β2與β3兩個半胱氨酸殘基（半胱氨酸93和半胱氨酸113）在β圓柱體的上方形成一個的二硫化物鍵。兩個半胱氨酸殘基之間的序列形成一個能移動的、可溶的loop。

SEB的二區(qū)和其他微生物的超抗原是不一樣的。它包含逆向平行的β折疊（β6-β12股）包著處于中心的α螺旋，β6股逆向平行β7，β7平行β12；β9逆向平行β12和β10。最近有關(guān)報道了二區(qū)可能結(jié)合p85蛋白質(zhì)。N端尾部（殘基1到20）在二區(qū)的表面。殘基14到17?在二區(qū)的頂部形成一個310-螺旋回轉(zhuǎn)（作為α1螺旋被標(biāo)記）。葡萄球菌核酸中發(fā)現(xiàn)了OB-折疊，并在一些毒素和無關(guān)序列的非毒素蛋白質(zhì)中出現(xiàn)。在蛋白質(zhì)進(jìn)化的過程中關(guān)于OB-折疊提出了很多觀點(diǎn)。OB折疊在超抗原進(jìn)化過程中是否結(jié)合二氧化碳分子仍然沒有闡明。盡管這樣，一個半乳糖類似物即半乳糖神經(jīng)酰胺（半乳糖α1-4半乳糖β1-1神經(jīng)酰氨）已經(jīng)被證明作為SEB受體起到重要作用。SEB結(jié)合MHC??的親和力很高（K_d-10^-6），它能結(jié)合小鼠的T細(xì)胞Vβ3，7，8.1，8.1，8.3，和17。根據(jù)SEB的拓?fù)洚悩?gòu)和突變研究，T-細(xì)胞受體結(jié)合部位被SEB區(qū)域1和區(qū)域2形成的淺槽包圍。SEB分子中α5螺旋，面對著結(jié)合MHC??分子的鄰近位點(diǎn)。

SEB是一種熱穩(wěn)定蛋白。由于最開始過快的加熱，在高溫條件下會造成SEB活性的減弱。當(dāng)毒素在PH7.3，100℃，加熱5min，它的活性損失少于50%。SEB會抵抗變性劑的變性作用，比如尿素和鹽酸胍。