[發明專利]甘露聚糖酶及其突變體

有效

• 申請號: 201310077948.2
• 申請日: 2011-08-16
• 公開（公告）號: CN103184206A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發明（設計）人: 黃亦鈞;程斯達;許韡;王華明;陳亮珍;劉魯民;陳剛
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/19;C12N1/21
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

本申請是申請日為2011年8月16日、申請號為201110234218.X、“甘露聚糖酶及其突變體”的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及甘露聚糖酶及其突變體，屬于微生物工程技術領域。

背景技術

β-1,?4-D-甘露聚糖酶（EC?3.2.1.78）又稱為甘露聚糖酶，它能水解含有β-1,?4-D-甘露糖苷鍵，生成甘露寡糖或甘露多糖，屬于半纖維素酶類。

在自然界中，甘露聚糖是僅次于纖維素的第二大可再生的半纖維素碳水化合物，廣泛存在于植物細胞壁，尤其是在豆科植物種子中，半乳糖-甘露聚糖含量高達干重的20%以上。同時，甘露聚糖的結構也有很多種，如半乳糖-甘露聚糖、葡萄糖-甘露聚糖和半乳糖-葡萄糖-甘露聚糖等。半乳糖-甘露聚糖的結構是主鏈由β-1,?4-D-甘露糖苷鍵連接而成的甘露聚糖，側鏈則是α-1,?6-半乳糖苷鍵連接的半乳糖。葡萄糖-甘露聚糖主鏈是由β-1,?4-D-甘露糖苷鍵連接而成，但其主鏈上一些甘露糖被葡萄糖取代。

半纖維素酶，包括甘露聚糖酶、木聚糖酶和葡聚糖酶等，廣泛用于纖維素生產乙醇、食品、飼料和造紙等行業。飼用酶制劑要適應動物如豬和禽類等的消化道特點，需要具有耐酸性強，同時在pH6.0~7.0范圍活性最強等特點。大豆粕是生產飼料的重要原料，如果在飼料中添加適量甘露聚糖酶，既能提高飼料的消化率，又能降低飼料成本（楊鴻昆等，2007，飼料研究；段蕾等，2008，飼料研究；范志恒，2008，飼料工業）。

很多微生物能產甘露聚糖酶，包括曲霉，芽孢桿菌甚至是鏈霉菌等。但是，通過菌種的篩選和誘變選育的自然菌株所產的甘露聚糖酶的酶活水平≤100U/ml，往往不能滿足工業生產的需要（楊文博，1995，微生物通報）。因此，克隆基因進行異源表達而獲得高效表達工程菌是當前開發甘露聚糖酶的熱點（丁宏標等，2006，畜牧與飼料；譚秀華等，2005，微生物學報）。

作為飼料添加劑，尋找高酶活、耐酸和最適溫度接近體溫的甘露聚糖酶是當前研究的熱點和難點。而蛋白質工程改造是獲得理想蛋白的重要手段之一。定向進化是獲得理想的飼用甘露聚糖酶的重要手段（毛紹名等，2007，微生物通報）。定向進化是利用隨機突變而篩選大量突變體來獲得目的蛋白，其工作量大，偶然性也非常大（張紅纓等，1999，科學通報；許欽坤等，2005，生物技術通訊）。而理性設計雖然工作量相對較小，但是往往難于找到合適氨基酸位點進行突變改造（張秀艷等，2006，生物工程雜志；王凡業等，2006，應用化工）。

本發明提供了pH偏中性的甘露聚糖酶及其多個酶的突變體。這些突變體是從地衣芽孢桿菌的不同菌株中克隆得到，它們間不完全同源，同源性為99%。盡管這些突變體的同源性非常高，但是彼此間活性（比活）存在很大的差異。這說明這些突變/取代位點是影響其活性的關鍵位點，這為甘露聚糖酶的定向進化和理性設計通過提供了可供選擇的關鍵位點和方向。

發明內容

本發明的目的是提供高酶活的甘露聚糖酶及其變體。

本發明提供了新的重組甘露聚糖酶及其突變體，其中所述重組甘露聚糖酶的氨基酸序列：

（a）?????包含選自SEQ?ID?NO:?2、SEQ?ID?NO:?4、SEQ?ID?NO:?6、SEQ?ID?NO:?8、、SEQ?ID?NO:10或SEQ?ID?NO:?12其中之一；或者

（b）????是在選自SEQ?ID?NO:?2、SEQ?ID?NO:?4、SEQ?ID?NO:?6、SEQ?ID?NO:?8、、SEQ?ID?NO:10或SEQ?ID?NO:?12其中之一上取代、缺失或添加一個或數個氨基酸殘基得到。

在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?2，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?1。

在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?4，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?3。

在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?6，，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?5。

在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?8，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?7。

在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?10，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?9。

在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?12，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?11。