[發(fā)明專利]一種核酸檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310077797.0
• 申請(qǐng)日: 2013-03-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103255208A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王琳;韓玉龍;胡杰;徐峰;盧天健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西安交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 汪人和

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及核酸檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

1.核酸檢測(cè)的意義

細(xì)菌、病毒及其他病原微生物均具有獨(dú)特的核酸序列，這些特定序列的檢測(cè)在食品安全、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域起著至關(guān)重要的作用。

1.1食品安全

食品和水與空氣一樣是人類生活的必需品，是人類生命的能源。然而，在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷售的各個(gè)環(huán)節(jié)中，微生物的大量繁殖會(huì)引起食品腐敗變質(zhì)，導(dǎo)致食源性感染或食物中毒。隨著近年來(lái)環(huán)境污染的不斷加劇，病原微生物對(duì)人類所造成的威脅越來(lái)越大，尤其是近年來(lái)世界各國(guó)相繼發(fā)生的重大食品安全事件，給食品安全敲響了警鐘。作為微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化方法操作繁瑣，需要時(shí)間較長(zhǎng)，其準(zhǔn)備和收尾工作繁重，且需要大量專業(yè)技術(shù)人員參與。核酸檢測(cè)技術(shù)可特異性識(shí)別病原體中的保守核酸序列，已被用于檢測(cè)大腸桿菌、痢疾桿菌等食物中常見(jiàn)的病原體。

1.2疾病診斷

分子生物學(xué)研究表明基因中核酸序列的微小變化可能導(dǎo)致諸如癌癥、心腦血管疾病、遺傳性疾病等一系列疾病，致病基因的改變通常發(fā)生在病變的早期，因此有可能根據(jù)核酸的改變來(lái)早期診斷疾病。此外，由于被細(xì)菌或病毒感染者攜帶有細(xì)菌或病毒的基因，通過(guò)分析個(gè)體中細(xì)菌或病毒特異的核酸，可診斷傳染性疾病，如肺結(jié)核、艾滋病等。而這些疾病的檢測(cè)，對(duì)于傳染疾病的控制與預(yù)防具有重大意義。

1.3環(huán)境監(jiān)測(cè)

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，環(huán)境問(wèn)題日益突出。環(huán)境污染問(wèn)題不僅影響我國(guó)人民的生存環(huán)境和生存質(zhì)量，危害人民的身體健康，同時(shí)也制約著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，加強(qiáng)環(huán)境保護(hù)工作顯得越來(lái)越重要。環(huán)境監(jiān)測(cè)是環(huán)境保護(hù)工作的基礎(chǔ)，環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)是環(huán)境管理與決策的基本依據(jù)。可以說(shuō)，離開(kāi)了環(huán)境監(jiān)測(cè)工作的支持，整個(gè)環(huán)保工作都將陷入被動(dòng)的局面。核酸檢測(cè)可準(zhǔn)確檢測(cè)環(huán)境中的有害生物，如水樣中的霍亂弧菌，空氣中的產(chǎn)氣莢膜桿菌以及海洋中的已知病菌和有害生物（如某些藻類）等。這對(duì)于預(yù)防和控制赤潮、水質(zhì)污染、大氣污染等重大環(huán)境問(wèn)題具有重要意義。

2.核酸檢測(cè)的方法

發(fā)展簡(jiǎn)易、快速、低成本、可重復(fù)利用的核酸檢測(cè)方法對(duì)于以上應(yīng)用具有重要意義，也是目前核酸檢測(cè)的發(fā)展方向的主要趨勢(shì)。

目前常用的核酸檢測(cè)方法主要包括電泳法，紫外分光光度法以及熒光法。前兩者主要用于終點(diǎn)檢測(cè)，而熒光法用于實(shí)時(shí)檢測(cè)，較前兩者對(duì)儀器的要求和成本要高。而電泳法操作較繁瑣，耗時(shí)也長(zhǎng)，因而主要用于實(shí)驗(yàn)室；紫外分光光度雖然操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)也短，但對(duì)樣品純度要求較高，易受雜質(zhì)干擾。因而世界各地都在積極研發(fā)簡(jiǎn)易、快速而低廉的核酸檢測(cè)方法，其中試紙法不僅完全滿足上述要求，而且靈敏度高，特異性好，最近幾年倍受專家學(xué)者關(guān)注；但其中一個(gè)突出的問(wèn)題就是其制備還依賴于昂貴而精密的儀器加工，并且一般只能一次性使用，因而對(duì)于一般家庭衛(wèi)生保健以及長(zhǎng)期跟蹤，還需要進(jìn)一步改進(jìn)和提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)易、快速、低成本、并且可重復(fù)利用的核酸檢測(cè)方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案。

1）確定檢測(cè)所需的特異性核酸目標(biāo)片段，然后制備捕獲溶液、檢測(cè)溶液以及對(duì)照溶液，所述捕獲溶液含有與特異性核酸目標(biāo)片段的一端互補(bǔ)的捕獲探針，捕獲探針上連接有顯色顆粒，檢測(cè)溶液含有與特異性核酸目標(biāo)片段的另一端互補(bǔ)的檢測(cè)探針，對(duì)照溶液中含有與捕獲探針互補(bǔ)的對(duì)照探針，檢測(cè)探針以及對(duì)照探針上連接有用于與試紙結(jié)合的分子；

2）將捕獲溶液、檢測(cè)溶液和對(duì)照溶液分別注入三支加樣筆的筆桿中，所述加樣筆還包括筆頭，筆頭的前端開(kāi)設(shè)有溶液流出孔，溶液流出孔內(nèi)設(shè)置有可以轉(zhuǎn)動(dòng)的球珠，筆頭的后端與筆桿相連通，注入捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤汉螅妹芊庥蛯⒐P桿密封；

3）依次持三支加樣筆在試紙上書寫線條，由捕獲溶液構(gòu)成的線條A位于試紙的下端，由對(duì)照溶液構(gòu)成的線條C位于試紙的上端，由檢測(cè)溶液構(gòu)成的線條B位于線條A與線條C之間；

4）待構(gòu)成線條的溶液干燥后，將試紙的下端浸潤(rùn)于待測(cè)樣品中，保持線條A位于待測(cè)樣品的上方，待線條C顯色并穩(wěn)定后取出試紙，觀察線條B的顯色情況。

所述加樣筆還包括用于連接筆頭與筆桿的連接裝置。

所述書寫是指將筆頭前端接觸試紙，然后驅(qū)動(dòng)筆頭在試紙上移動(dòng)，使筆頭前端的球珠轉(zhuǎn)動(dòng)，帶動(dòng)筆桿內(nèi)的捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤毫鞒觯鞒龅牟东@溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤和糠笥谠嚰埳稀?/p>

所述球珠的直徑為100nm-1cm。