[發明專利]用于甾體化合物A環1,2位脫氫的基因工程菌及發酵劑

有效

• 申請號: 201310077602.2
• 申請日: 2013-03-12
• 公開（公告）號: CN103255095B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發明（設計）人: 路福平;田耀;張會圖;劉曉光
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/02;C12P33/02;C12R1/06
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司12209
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明屬于基因工程和微生物發酵領域，涉及用于甾體類化合物高效轉化（A環1,2位脫氫）的簡單節桿菌，尤其是一種用于甾體化合物A環1,2位脫氫的基因工程菌及發酵劑。

技術背景

甾體類藥物具有重要的生理活性，在臨床上有廣泛的應用，是僅次于抗生素的第二大類藥物。醋酸可的松C1,2位上導入雙鍵后成醋酸潑尼松，抗炎作用能夠提高3-4倍，并且減少由鈉滯留而帶來的副作用。目前甾體藥物生產中常用的方法有化學合成和微生物轉化兩種，化學方法進行C1,2位脫氫一般采用二氧化硒法，該方法常使產品中帶有少量難以除盡對人體有害的硒，微生物轉化法具有成本低、對環境溫和等優點，越來越受到人們的重視。

簡單節桿菌(Arthrobacter?Simplex)的C1,2位脫氫反應是工業生產醋酸潑尼松及其同系物最有價值的一種反應，也是采用發酵法工業生產甾類藥物的典型代表。目前甾體微生物轉化主要研究的領域主要在以下幾個方面：提高水不溶性底物的溶解度，細胞和酶的固定化以利于酶的重復利用，發展經濟有效的產物連續回收方式等用來提高產量，但是尋找、篩選更優良菌種來提高轉化率才是更加長期有效的方法。目前國內在這步反應中仍在使用原始菌株，很少在分子水平上進行深入的探索，尚無基因工程菌研發成功，這也限制了國內甾體藥物生產的進一步發展。隨著分子生物學的發展和人們對甾體代謝機制研究的深入，基因工程菌在甾體藥物生產中必將得到廣泛的應用。

Choi等（1995,Journal?of?bacteriology1779（5），4152-4156）描述了簡單節桿菌(Arthrobacter?Simplex)菌株中C1,2位脫氫基因（KsdD）的基因序列、成功的將此基因異源表達于鏈霉菌并研究了此酶的性質，但并未對簡單節桿菌本身進行分子改造，簡單節桿菌本身的遺傳背景不清楚，通過同源重組構建高效生物轉化簡單節桿菌還未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于甾體化合物A環1,2位脫氫的基因工程菌及發酵劑，本發明通過基因工程技術，對簡單節桿菌進行同源重組，利用質粒pXJM19上攜帶的氯霉素抗性基因的啟動子啟動A環1,2位脫氫酶目的基因轉錄，實現A環1,2位脫氫酶在出發菌中高水平表達。

本發明的另一個目的是利用該工程菌株進行生物轉化方法改進，使工程菌的轉化效率達到最高。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種用于甾體化合物A環1,2位脫氫的基因工程菌，所述基因工程菌的宿主菌為簡單節桿菌（Arthrobacter?Simplex），保藏編號為ACCC?12070，所述基因工程菌內含有如序列10所述的重組基因片段。

而且，所述基因工程菌的發酵底物包括醋酸可的松、含氟皮質激素、4-AD。

而且，所述基因工程菌的培養基為：酵母提取物5wt%-8wt%、磷酸鹽1.5wt%-3wt%、玉米漿10wt%-15wt%和葡萄糖8wt%-12wt%。

而且，所述基因工程菌采用分次補加底物、酒精、水的乳濁液的連續緩慢流加的發酵方法。

用于甾體化合物A環1,2位脫氫的基因工程菌在發酵生產A環1,2位脫氫酶中的應用。

一種甾體化合物A環1,2位脫氫發酵劑，包括權利用于甾體化合物A環1,2位脫氫的基因工程菌。

本發明的優點及有益效果如下：

1、本發明構建的工程菌在含有酵母提取物（5%-8%）、磷酸鹽（1.5%-3%）、玉米漿（10%-15%）和葡萄糖（8%-12%）等營養成分的基礎上，通過恒溫通氣攪拌發酵，在甾體化合物濃度不高于10%（g/L）時，采用一次加投甾體化合物底物，在32～48小時內生物脫氫轉化率能夠達到95%以上；在甾體化合物濃度高于10%時，采用連續補加甾體化合物底物的情況下，在60小時內生物脫氫轉化率能夠達到95%以上。

2、本發明構建的菌株為進一步為通過分子手段改善生物轉化制劑以及提高醫藥中間體和化學品的生物轉化效率提供一種有效的方法，具有重要的實用意義。

附圖說明

圖1為本發明中重組載體的構建過程；

圖2為本發明所構建載體pTY5PCR驗證的核酸電泳圖其中M:DNA?Marker1、2均表示重組載體驗證結果；

圖3為本發明所構建菌株中PCR驗證的核酸電泳圖其中M:DNA?Marker1、2：同源重組成功，3：未被重組；