[發(fā)明專利]核酸擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)時檢測裝置

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310077508.7
• 申請日: 2007-03-01
• 公開（公告）號: CN103232936A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 玉置裕一;巖間明文;園田泰亮
• 申請（專利權(quán)）人: 松下健康醫(yī)療器械株式會社
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;G01N21/64
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 張平元

此案是申請日為2007年3月1日、中國申請?zhí)枮?00780008043.2、PCT申請?zhí)枮镻CT/JP2007/053949的發(fā)明名稱為“核酸擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)時檢測裝置”的發(fā)明申請的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及對聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase?chain?reactin：PCR)所得多核苷酸產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時檢測的裝置。

背景技術(shù)

PCR是對DNA鏈進(jìn)行復(fù)制的循環(huán)性酶反應(yīng)，其出于以下原因能夠?qū)ψ鳛槟繕?biāo)的目標(biāo)序列分子進(jìn)行指數(shù)函數(shù)式的擴(kuò)增：將在先循環(huán)中復(fù)制的PCR產(chǎn)物(核酸擴(kuò)增產(chǎn)物)用作在后循環(huán)的模板。在實(shí)時PCR中，例如使用相干的兩種熒光染料標(biāo)記的序列特異性探針(TaqMan探針)，用激發(fā)光照射PCR產(chǎn)物，激起熒光并測定熒光強(qiáng)度，從而對PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測。

而且，當(dāng)用于定量時，對于已知樣品擴(kuò)增曲線的指數(shù)函數(shù)擴(kuò)增范圍設(shè)定閾值(圖7的(6))，然后計(jì)算出該閾值與擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)(閾值循環(huán)數(shù)Ct，圖7的(8))。當(dāng)以Log值的形式來表示初期DNA量時，該閾值循環(huán)數(shù)Ct與檢測樣品的初期DNA量之間存在線性關(guān)系，可以制作出表示該線性關(guān)系的校正曲線。以該校正曲線為基準(zhǔn)可以推知檢測樣品的初期DNA量。這樣，就能夠基于PCR的擴(kuò)增速度理論進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。

在這里，由于實(shí)際的PCR效率不是100%，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的濃度可以以式(1)表示。

[DNA]=[DNA]₀(1+e)^c····(1)

[DNA]：PCR產(chǎn)物的濃度

[DNA]₀：目標(biāo)模板的初期濃度

e：平均PCR效率

c：循環(huán)數(shù)

即，如果平均PCR效率e為100%(即，上式(1)中e=1)，則PCR產(chǎn)物的濃度[DNA]為2的循環(huán)數(shù)次方，呈指數(shù)函數(shù)式地?cái)U(kuò)增。然而，在循環(huán)的初期、中期和后期，效率e逐漸降低，擴(kuò)增曲線為圖7所示的狀況。圖7的橫軸為循環(huán)數(shù)、縱軸為熒光強(qiáng)度，循環(huán)初期以指數(shù)函數(shù)的形式擴(kuò)增(圖7的(5))，循環(huán)中期以線性函數(shù)的形式擴(kuò)增(圖7的(6))，而循環(huán)后期則由于平臺效應(yīng)而不再擴(kuò)增(圖7的(7))。

而且，引起平臺效應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)方面的因素如下。

·dNTP和引物的水解

·DNA聚合酶(生產(chǎn)模板拷貝的DNA合成酶)的熱失活

·單鏈PCR片段的復(fù)性引起的引物退火效率降低

·非特異性PCR產(chǎn)物的競爭因素

·焦磷酸酯等PCR抑制物的積累

·DNA聚合酶的外切酶活性引起的PCR產(chǎn)物水解

因此，實(shí)時PCR的前提條件是在上式(1)的關(guān)系成立的指數(shù)函數(shù)擴(kuò)增范圍內(nèi)進(jìn)行測定(專利文獻(xiàn)1)。

專利文獻(xiàn)1：特表2005-516630號公報(bào)

專利文獻(xiàn)2：專利第2909216號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明所要解決的問題

此外，作為實(shí)時PCR中使用的反應(yīng)容器，一般使用稱作微孔板的具有多個孔(由凹陷構(gòu)成的反應(yīng)區(qū)，例如96個)的容器。雖然向各孔中分加了一定初期DNA濃度的反應(yīng)溶液，但由于裝置方面的下述誤差因素，反應(yīng)容器的各個孔的擴(kuò)增曲線存在偏差。

·光學(xué)系統(tǒng)的誤差

·校正溶液的濃度誤差

·校正溶液的分加誤差

·反應(yīng)容器的蓋或封口膜的光透過性誤差

·反應(yīng)容器的污染誤差

·反應(yīng)溶液的分加誤差

這里，由于價(jià)格低廉的關(guān)系，下述方法成為給反應(yīng)容器(微孔板)的孔加蓋的主流方法：在反應(yīng)容器的一面的整個區(qū)上粘貼帶有粘合劑的前述封口膜。而且，激發(fā)光通過封口膜照射到各孔，PCR產(chǎn)物(反應(yīng)產(chǎn)物)發(fā)出的熒光也是通過封口膜才被CCD相機(jī)等光檢測部檢測到(這些構(gòu)成裝置的光學(xué)系統(tǒng))。這樣，雖然封口膜、反應(yīng)容器本體構(gòu)成了熒光強(qiáng)度測定方面的光學(xué)系統(tǒng)的重要要素，但是，這些均屬易耗品，很難指望它們具有均一且高精度的光學(xué)性能。

圖4為光檢測部所檢測到的PCR前的反應(yīng)容器的實(shí)際圖像。從整體來看，反應(yīng)容器的孔的周圍是黑色的，但是，作為背景的該圖像各像素的亮度(背景熒光強(qiáng)度)卻并非一定，如該圖的(1)中所示，由于光學(xué)系統(tǒng)的污染、雜散光(迷走光)等出現(xiàn)了斑點(diǎn)。如果開始PCR反應(yīng)，則該斑點(diǎn)會如圖5的(2)中所示那樣，與孔部分的圖像(圖5中顯示為圓形的96個圖像)重疊，而被孔本體的熒光強(qiáng)度拉長。