[發(fā)明專利]一種豬水皰病檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310077132.X
• 申請(qǐng)日: 2013-03-11
• 公開（公告）號(hào): CN103160616A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張強(qiáng);朱海霞;吳國(guó)華;趙志荀;顏新敏;李健;蘆曉立;于少雄;盧昌;王曼;朱彩珠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種病原微生物檢測(cè)用試劑盒，屬于病原微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于豬水皰病檢測(cè)的試劑盒。

背景技術(shù)

豬水皰病(Swine?vesicular?disease,SVD)是由小RNA病毒科(?Picornaviridae)?腸道病毒屬(?Enterovi?rus)豬水皰病病毒（SVDV）引起的一種急性接觸性傳染病。本病于1966?年首先發(fā)現(xiàn)于意大利的一個(gè)豬場(chǎng),隨后在歐洲的許多國(guó)家相繼發(fā)生流行蔓延,引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失并導(dǎo)致世界肉類市場(chǎng)的混亂,因而本病受到極大關(guān)注，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其列為一類動(dòng)物疾病。快速和可靠的診斷對(duì)于豬水皰病的控制和消滅至關(guān)重要，而且對(duì)肉食品中低含量的豬水皰病病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的方法，必須具備高敏感性、高特異性和高準(zhǔn)確性。常規(guī)的診斷方法如病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)等，或費(fèi)時(shí)費(fèi)力，或特異性和敏感性不高,不能滿足快速、準(zhǔn)確診斷的要求。現(xiàn)有的RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR?和ELISA-PCR?方法克服了這些方法的不足，可用于豬水皰病的診斷，但也有費(fèi)時(shí)、易污染和每次檢測(cè)的樣品數(shù)量少等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足的用于檢測(cè)豬水皰病的試劑盒。

本發(fā)明的豬水皰病檢測(cè)試劑盒中包括兩對(duì)引物，分別是上游外引物SEQ?№?1，下游外引物SEQ?№?2，上游內(nèi)引物SEQ?№3和下游內(nèi)引物SEQ?№4。

根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的豬水皰病檢測(cè)試劑盒內(nèi)放置的外引物與內(nèi)引物的最佳比例為外引物︰內(nèi)引物等于1︰8。

為方便本發(fā)明的試劑盒的使用，本發(fā)明的豬水皰病檢測(cè)試劑盒內(nèi)還有10×LAMP反應(yīng)緩沖液、一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物、Bst?DNA聚合酶、AMV?反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、硫酸鎂（MgS0₄）、甜菜堿（Betaine）和滅菌雙蒸水。

本發(fā)明工作原理是：反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)過程是在60～65℃左右對(duì)RNA進(jìn)行同步反轉(zhuǎn)錄和等溫?cái)U(kuò)增，由外引物擴(kuò)增出內(nèi)引物擴(kuò)增所需要的模板即起始反應(yīng)物模板的合成；緊接著由內(nèi)引物引導(dǎo)合成靶基因的DNA片段，由于內(nèi)引物擴(kuò)增的DNA片段含有該引物5′端DNA片段的反向互補(bǔ)序列，因而這些反向互補(bǔ)序列之間通過雜交形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，另外一條內(nèi)引物與其互補(bǔ)鏈退火雜交后引導(dǎo)鏈置換合成反應(yīng)，在擴(kuò)增的DNA片段的另外一端產(chǎn)生了新的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，由于擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段的混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜。LAMP的整個(gè)反應(yīng)分三步完成，即起初反應(yīng)物模板的合成、循環(huán)擴(kuò)增階段、延伸和再循環(huán)。

反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reverse?transcription?loop?mediated?isothermal?amplification，RT-LAMP)是一種新型的RNA擴(kuò)增技術(shù)，與現(xiàn)有的核酸擴(kuò)增方法相比有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)過程中不需經(jīng)普通PCR的變性、復(fù)性和延伸，可在恒溫條件下1小時(shí)內(nèi)高效率地?cái)U(kuò)增目的基因；不需要特殊的儀器設(shè)備，適于基層獸醫(yī)站、養(yǎng)殖場(chǎng)戶及進(jìn)出口檢疫等部門的使用和推廣；擴(kuò)增主要依賴針對(duì)靶基因6個(gè)特定區(qū)域的4條特異性引物，特異性高。RT-LAMP快速診斷方法能夠克服目前檢測(cè)方法中存在的耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、敏感性差及假陰性等不足，具有簡(jiǎn)單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。利用這種檢測(cè)方法可以對(duì)肉制品，隱性感染或持續(xù)帶毒動(dòng)物組織樣品中的低含量豬水皰病病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)和對(duì)發(fā)病動(dòng)物進(jìn)行早期快速鑒別診斷。

由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果:

1、本發(fā)明利用Bst?DNA聚合酶的鏈置換特性，設(shè)計(jì)4特異條引物，識(shí)別靶序列的6個(gè)特定區(qū)域，在等溫條件下生成大量重復(fù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在檢測(cè)時(shí)不需要任何特殊設(shè)備。

2、本發(fā)明的敏感性高于普通RT-PCR技術(shù)。

3、本發(fā)明由于不需經(jīng)過RT-PCR技術(shù)的3個(gè)溫度的重復(fù)循環(huán)，檢測(cè)時(shí)間比RT-PCR短，一小時(shí)內(nèi)即可完成。

4、本發(fā)明的反應(yīng)溫度在60～65℃左右，且識(shí)別靶基因6個(gè)特定區(qū)域，引物多聚體及非特異性擴(kuò)增幾率大大降低，特異性大大提高。

附圖說明????

圖1是本發(fā)明中溫度優(yōu)化結(jié)果的電泳圖，圖中1–6泳道分別代表的反應(yīng)溫度為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃?和65℃，由圖示結(jié)果確定擴(kuò)增最佳溫度為62℃。