[發明專利]一種產熱穩定性重組胰蛋白酶的酵母工程菌及其應用

無效

• 申請號: 201310076829.5
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN103173367A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 陳堅;令楨民;馬騰博;堵國成;康振;李江華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/76;C12R1/84;C12R1/545
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種產熱穩定性重組胰蛋白酶的酵母工程菌及其應用，其特征在于采用畢赤酵母宿主(Pichia?pastoris)GS115為宿主，表達重組胰蛋白酶基因，所述重組胰蛋白酶基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

2.權利要求1所述酵母工程菌的構建方法，其特征在于具體步驟為：?

1）熱穩定性提高的重組胰蛋白酶基因的獲得?

利用融合PCR技術或化學全合成的方法，將人工設計前導肽Ex核苷酸序列和灰色鏈霉菌（Streptomyces?griseu）胰蛋白酶編碼基因mt進行融合，并將連接至pMD19Tsimple載體中；所述前導肽Ex核苷酸序列為TACGTTGAATTT；?

2）融合前導肽的重組酶表達質粒的構建?

利用融合PCR技術在其5’端融合Saccharomyces?cerevisiaeα-factor信號肽，得到亞克隆片段α-factor?signal?peptide+Exmt，之后將亞克隆片段利用BamHI和NotI酶切亞克隆至表達載體pPIC9K，獲得重組表達質粒pPIC9K-α-factor?signal?peptide+Exmt；?

3）融合雙親短肽的重組酶表達菌株的構建?

將重組質粒pPIC9K-α-factor?signal?peptide+Exmt轉化宿主畢赤酵母宿主(Pichia?pastoris)GS115。?

3.一種應用權利要求1所述所述酵母工程菌發酵生產重組胰蛋白酶的方法，其特征在于以權利要求1所述的酵母工程菌為生產菌株，接種一環轉化子入250mL三角瓶，裝液量50mL的種子培養基，培養溫度28℃～30℃，搖床轉速200r/min，培養24h；離心，收集種子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，按10%的接種量接入裝液量為50mL發酵培養基的三角瓶中，發酵溫度30℃，搖床轉速200r/min，發酵時間：3～4天。?

4.權利要求3所述的方法，其特征在于所述種子培養基1L組成為：蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化鈉5-15。

5.權利要求3所述的方法，其特征在于所述發酵培養基1L組成為：酵母氮源基礎培養基12～15，生物素0.0002～0.0005，甲醇10～50；微量元素溶液，MnSO₄·4H₂O100，ZnCl₂70，Na₂MoO₄·2H₂O35，H₃BO₃60，CoCl₂·6H₂O200，CuSO₄·5H₂O29，NiCl₂·6H₂O25，37%鹽酸0.9mL。?