[發明專利]一種細胞共培養誘導干細胞體外定向分化的方法

有效

• 申請號: 201310076563.4
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN104046589A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 馬小軍;劉洋;連建春;孫廣煒;賀欣
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/0775;C12N5/0797;C12N5/0789;C12N5/071;C12N5/079;C12N5/077
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及再生醫學領域，是一種細胞共培養誘導干細胞體外定向分化的方法。

背景技術

干細胞由于具有自我更新和向神經、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨或脂肪等多種類型細胞分化的能力，是再生醫學的理想種子細胞。但是由于干細胞自發分化具有不可控性，當干細胞植入體內受損組織后，干細胞除了分化為所需要的細胞類型，參與組織修復，同時也分化為其它類型的細胞，甚至具有較高的致瘤性。對干細胞進行體外預分化，使之在移植之前預先分化為所需類型細胞或其前體細胞，能夠提高定向分化效率，減低干細胞在體內向其它類型細胞分化的能力，從而提高修復效果，降低致瘤風險。

目前，體外誘導干細胞定向分化的方法包括生長因子組合/化學試劑誘導以及細胞共培養誘導。大量研究表明高劑量的生長因子組合或者化學試劑盡管能夠刺激干細胞產生目的細胞的表型，但是所獲得分化細胞缺乏長期的生理功能，并且容易引發細胞變異，因此此種方法存在有效性和安全性方面的問題。細胞共培養是使用具有目的細胞表型的誘導細胞和干細胞進行體外共培養，此種方法可以模擬體內特異組織細胞微環境，所獲得的分化細胞具有接近體內特異組織細胞的生理功能，具有臨床應用潛力。

體內細胞微環境主要構成要素有細胞和細胞、細胞和細胞外基質以及細胞和可溶性因子之間的相互作用。研究表明可溶性因子的種類和濃度、細胞外基質的成分和剛度均對干細胞的定向分化均有重要的調控作用，因此體外細胞共培養體系的設計應考慮到這些要素對分化的協同影響。目前常用的共培養體系包括直接接觸共培養以及Transwell共培養體系。直接接觸共培養體系將誘導細胞和干細胞進行混合培養，盡管此體系較為接近體內細胞微環境，但是誘導細胞和干細胞相互污染，不能應用于臨床。Transwell共培養體系盡管利用多孔平板膜將兩種細胞隔開，避免了細胞分離問題，體現了細胞和細胞之間、細胞和因子之間的相互作用，但是缺乏細胞外基質成分和剛度的影響，并且不能調整可溶性因子在兩種細胞之間的濃度分布，因而限制了干細胞分化效率以及分化細胞功能水平的提高，并且此體系價格昂貴，使得實驗成本大大增加。

由于現有細胞共培養體系存在上述主要缺陷，嚴重限制了干細胞體外定向分化技術的進一步發展與應用，因此急需研發便捷實用的可多角度模擬體內細胞微環境中細胞之間、細胞和細胞外基質之間以及細胞和可溶性因子之間相互作用的體外細胞共培養新方法，以實現體外對干細胞體外定向預分化的調控，進一步促進干細胞在再生醫學領域的應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種細胞共培養誘導干細胞體外定向分化的方法，即利用瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠實現誘導細胞和干細胞的非接觸共培養，通過改變平板復合凝膠的剛度和厚度可調控干細胞的定向分化，同時實現不同類型細胞之間的分離，以獲得純凈的分化細胞。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

在培養皿底部裝一環形墊片，先將干細胞接種在環形墊片所形成的環形區域之內，置于培養箱內培養，待細胞貼壁后再將瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液加到該環形區域，使混合溶液液面高度超過墊片厚度2mm。之后于環形墊片上平鋪一個玻璃板，將玻璃板緊密壓在墊片之上，待環形墊片內的混合溶液固化后，揭去玻璃板，加入CaCl₂溶液進行鈣化，之后加入殼聚糖溶液進行反應，從而在干細胞之上形成了一層瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠。然后在平板復合凝膠表面接種誘導細胞，從而在同一個培養體系中實現了干細胞和誘導細胞的非接觸共培養，通過改變瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液中瓊脂糖的質量濃度以及環形墊片的厚度可改變平板復合凝膠的剛度、厚度以及誘導細胞分泌的可溶性因子在復合凝膠中的濃度，進而調控干細胞的體外定向分化。

所述環形墊片包括金屬墊片或非金屬墊片，其厚度為10-3000μm。

所述干細胞包括胚胎干細胞、iPS細胞、間充質干細胞、神經干細胞、虹膜色素上皮細胞、羊膜上皮細胞、或造血干細胞，誘導細胞包括分離培養的體細胞或細胞系；

干細胞和誘導細胞可以是同源同種細胞、同源異種細胞、異源異種細胞；

調控干細胞向神經細胞分化的誘導細胞包括神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞、髓鞘細胞、或神經組織來源的腫瘤細胞系；

調控干細胞向心肌細胞分化的誘導細胞包括；原代心肌細胞或心肌細胞系；

調控干細胞向肝細胞分化的誘導細胞包括原代肝實質細胞、原代內皮細胞、內皮細胞系、肝星狀細胞、成纖維細胞、3T3細胞系、或肝組織來源的腫瘤細胞系；

調控干細胞向胰島細胞分化的誘導細胞包括原代胰島或β-胰島細胞；