[發明專利]鵝T細胞表面分子CD8α的檢測試劑盒與方法

有效

• 申請號: 201310076391.0
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN103131786A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 陳舜;程安春;汪銘書;趙秋榮
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/12;C07K14/705
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 秦力軍

1.鵝T細胞表面分子CD8αmRNA水平的檢測方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

A?PCR擴增

以如SEQ?ID?NO：1所示的cDNA為模板，以如SEQ?ID?NO：2所示的序列為正向引物，如SEQ?ID?NO：3所示的序列為反向引物，進行PCR擴增；

B判斷結果

在反應體系中進行PCR擴增不少于20個循環后，對PCR產物進行檢測，并進一步判斷mRNA是否存在、mRNA的相對含量或mRNA的絕對含量。

2.根據權利要求1所述的鵝T細胞表面分子CD8αmRNA水平的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法為實時熒光定量PCR法，采用SYBR?Green?I為熒光染料，具體包括以下步驟：

A?PCR擴增

以如SEQ?ID?NO：1所示的cDNA為模板，以如SEQ?ID?NO：2所示的序列為正向引物，如SEQ?ID?NO：3所示的序列為反向引物，進行PCR擴增；同時設定已知量的標準組；

B判斷結果

在反應體系中進行PCR擴增40個循環后，將待測樣品與標準組進行熒光強度比較，判定待測樣品mRNA的量。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟A中，以鵝的β-actin作內參基因設計引物，其正向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟A中，引物的終濃度為0.3μmol/L。

5.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，步驟A中，所述引物第一階段95℃?3min；第二階段95℃?30s，61.4℃?30s，各40個循環進行反應；所述內參引物第一階段95℃?3min；第二階段95℃?30s，60℃?30s，各40個循環進行反應。

6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述標準組的標準樣品為重組質粒pGEM-T-goCD8α，重組質粒pGEM-T-goCD8α由如SEQ?ID?NO：6所示的目的片段和pGEM-T?easy連接并轉化而得。

7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述重組質粒pGEM-T-goCD8α，將其以10倍體積梯度遞增稀釋6次，進行熒光定量PCR反應，得標準曲線。

8.鵝T細胞表面分子CD8α的cDNA序列及其編碼的氨基酸，其特征在于，所述cDNA序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：8所示。

9.基于實時熒光定量PCR的鵝T細胞表面分子CD8α的mRNA定量試劑盒，所述mRNA定量試劑盒包括組織RNA提取液、PCR擴增反應液，其特征在于：所述PCR擴增反應液中用于目的片段擴增的正向引物和反向引物，所述正向引物從5’到3’的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，所述反向引物從5’到3’的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。

10.根據權利要求9所述的mRNA定量試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內參基因PCR擴增反應液，所述正向內參引物從5’到3’的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示，所述內參反向引物從5’到3’的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示；

所述試劑盒還包括陰性質控品、陽性質控品。