[發明專利]一種植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復培養的方法

有效

• 申請號: 201310076086.1
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN103202225A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 林田;楊華;龍萍;朱天生;劉灶長;李天菲;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N3/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 何新平

1.一種植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復培養的方法，其特征在于，所述保存方法包含的步驟有：在解剖鏡下剝取無菌苗莖尖，浸入2%~5％無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸后，將莖尖排列在無菌濾紙條上，然后將其浸入0.1%氯化鈣溶液中，經10~20min固定后，再將帶有莖尖的濾紙條放入0.3~0.5mol·L^-1蔗糖的MS液體中培養1~3天，置于預處理溶液中處理20-40min轉入玻璃化保護劑中處理10~80min，然后將帶有莖尖的濾紙條轉移到無菌冷凍管中放入液氮中保存。

2.根據權利要求1所述的植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復培養的方法，其特征在于，所述經10~20min固定是指將含有莖尖的濾紙小條浸入到0.1%氯化鈣溶液中進行包埋固化。

3.根據權利要求1所述的植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復培養的方法，其特征在于，所述無菌濾紙條為3mm?x?20mm的無菌濾紙小條。

4.根據權利要求1所述的植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復培養的方法，其特征在于，所述預處理溶液為包含1-3?mol·L^-1甘油和0.2-0.6?mol·L^-1蔗糖的MS液體培養基,優選的預處理溶液為含2?mol·L^-1甘油和0.4?mol·L^-1蔗糖的MS液體培養基。

5.根據權利要求1所述的植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復培養的方法，其特征在于，所述玻璃化保護劑包含1.63-4.89mol·L^-1甘油、1.61-4.84mol·L^-1乙二醇、1.27-3.81mol·L^-1?DMSO和0.3-0.5mol·L^-1蔗糖，優選的玻璃化保護劑包含3.26?mol·L^-1甘油、2.42?mol·L^-1乙二醇、1.9?mol·L^-1?DMSO和0.4?mol·L^-1蔗糖。

6.一種植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復培養的方法，其特征在于，所述解凍、恢復培養的方法包含步驟有：將權利要求1~5保存的帶有莖尖的濾紙小條由冷凍管中取出，然后放入含1.2?mol·L^-1蔗糖的MS培養液解凍及洗滌20min；將解凍及洗滌后的莖尖放入恢復培養基進行暗光或弱光培養3天后轉入到常光培養，等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉入MS固體培養基中，莖尖可直接長成植株。

7.根據權利要求6所述的一種植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復培養的方法，其特征在于，所述恢復培養基為MS半固體培養基,所述MS半固體培養基包含0.5?mg·L^-1?BA、0.1?mg·L^-1?NAA和?0.5?mg·L^-1?GA3。