[發明專利]熒光定量PCR檢測醋醅中醋酸菌和乳酸菌的方法

無效

• 申請號: 201310075466.3
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN103131785A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 許正宏;史勁松;陸震鳴;王宗敏;錢建瑛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及熒光定量PCR技術應用于固態釀醋微生物群落中特定種屬微生物的定量研究。?

背景技術

我國食醋的生產歷史悠久，但眾多的食醋生產廠家的發酵過程都以傳統的經驗為主，工藝可控性較差，并且產品品質存在批次差異，尤其是風味差異較大。這主要是由于釀造過程中微生物復雜多樣，對醋醅發酵過程中的微生物作用機制不清楚。中國食醋的釀造工藝是多菌種混合發酵工藝，通過多種微生物的代謝作用產生風味飽滿、酸味柔和的食醋。食醋的生產中有兩個主要的發酵階段：酒精發酵和醋酸發酵。在酒精發酵階段，淀粉質原料如糯米、高粱等經過霉菌和酵母菌的一系列代謝，最終生成酒精；而在醋酸發酵階段是包括醋酸菌、乳酸菌在內的眾多細菌起主要的作用，該階段是決定食醋風味和品質的關鍵步驟。醋酸菌屬和乳酸菌屬是醋酸發酵過程的優勢微生物，二者豐度之和在整個細菌群落中占到90%以上，闡明發酵過程中醋酸菌屬和乳酸菌屬生物量的動態變化對于控制食醋發酵過程以及提高產品的風味具有重要的生產意義。有鑒于此，探索和引入新的技術方法和手段以全面地了解傳統釀造系統中的微生物種類，進而闡明釀造過程中微生物的作用機制，已成為重新認識和改造傳統產業的迫切需求。?

熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現了DNA模板的定量，而且具有特異性強、靈敏度高、高通量、全封閉反應、定量準確、速度快及自動化程度高等特點。本發明成功運用了熒光定量PCR技術對醋醅中的優勢微生物—醋酸菌屬和乳酸菌屬的微生物進行定量，并得到兩種微生物的生物量在食醋發酵過程中的動態變化。?

發明內容

本發明的目的在于解決上述現有食醋固態釀造分析技術的不足，提供了一種分子生態技術用于定量檢測固態釀造食醋發酵過程中醋酸菌屬、乳酸菌屬的動態變化，以指導實踐。?

本發明是通過以下方案實現的，本發明針對醋醅群落中的醋酸菌屬、乳酸菌屬分別設計特異性引物，提取分離純化得到的葡萄糖醋酸桿菌(Gluco?nacetobacter?sp.)和戊糖乳酸菌(Lactobacillus?pentosus)的基因組，然后分別利用設計的特異性引物進行PCR得到特異性目的片段，再將目的片段與pMD19-T?Vector連接，獲得重組質粒，再將重組質粒轉化JM109大腸桿菌感受態細胞，挑取成功轉化的轉化子進行擴大培養，獲得高濃度質粒，然將此高濃度質粒做10倍比稀釋，作為熒光定量PCR的標準品。利用液氮研磨、酶法和高鹽結合的方法提取發酵過程中不同時間點醋醅群落的總DNA作為待測樣品，將標準樣品和待測樣品同時進行熒光定量PCR，標準樣品形成標準曲線，然后根據標準曲線分別計算待測樣品中醋酸菌和乳酸菌的含量。?

對于醋酸菌屬的熒光定量PCR方法，檢測拷貝數在6.94×10⁴-6.94×10¹¹?copies/μL范圍時，醋酸菌Real-time?PCR的擴增曲線為一組典型的倒S曲線，擴增曲線基線平整，指數區較明顯且陡度大，平臺區能夠匯于一起，線性范圍比較寬。質粒標準品的濃度越高，循環閾值CT越低。該標準曲線的線性方程是y=-0.353x+13.897,線性相關系數為0.9975，具有較好的線性關系，根據公式E=10^-k-1(k-標準曲線的斜率)，算得Real-time?PCR的擴增效率為1.18，在0.8-1.2之間，擴增效率理想。另外醋酸菌Real-time?PCR熔解曲線，在84℃左右出現單一的熔解峰，無引物二聚體及非特異性產物，曲線平穩，峰尖且窄，說明各濃度質粒的熔解溫度均一，擴增產物特異性好，以此為基礎進行定量是可靠的。?