[發明專利]一種水通道蛋白AqpZ的制備方法

無效

• 申請號: 201310074302.9
• 申請日: 2013-03-08
• 公開（公告）號: CN103173468A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 徐志南;潘劍峰;黃磊;蔡謹
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/245;C07K1/22
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明涉及一種蛋白的表達和純化方法，更具體地說，涉及一種采用麥芽糖結合蛋白/多聚組氨酸二元標簽表達系統在大腸桿菌中表達和純化得到水通道蛋白AqpZ的方法。

背景技術

水分子的跨膜運輸是生命的基本活動之一。水分子快速的跨膜運輸是生物體得以迅速地適應細胞外環境滲透壓變化的一個重要的因素。水通道蛋白Aquaporins是重要固有蛋白的重要成員之一。它是水分子進出細胞專一性的跨膜通道，因此在維持細胞內環境穩態發揮著重要的作用。水通道蛋白遍布整個生物界，從原核細菌到真核動植物都有水通道被鑒定出來。大腸桿菌水通道蛋白Aquaporin?Z?(AqpZ)?是第一個被發現的原核生物水通道蛋白。由于AqpZ的發現，一系列新的水通道蛋白家族成員也被陸續解析出來。所以水通道蛋白AqpZ?已經成為研究微生物水分子運輸、生物物理，生理及結構的模式蛋白。?AqpZ?的分子晶體結構已經被逐步的解析清楚。?AqpZ是由具有6個跨膜區域，5個相互連接的環和2個保守的NPA?box?(asparagines-proline-alanine)?裝配而成的。AqpZ的高度疏水性，經過強烈的壓縮之后形成了高度穩定且具有SDS抗性(SDS-Resistance)。在中性條件下，即使1%?的?SDS也不能使它解聚。在功能上，AqpZ對水有極高的滲透性，且該過程所需活化能很低，而且AqpZ是個“純”的水通道蛋白，不能夠運輸甘油和尿素等一些小分子。研究表明重整到脂質體后，AqpZ表現出高度滲透系數（P_f=10*10^-14?cm³s^-1subunit^-1）和低的滲透活化能?(Ea=3.8?kcal/mol)。以此速率，大約0.14μg水通道蛋白AqpZ就能回收2.4升的廢水（每個人每天最低需水量）。由于?AqpZ結構和功能上的優勢，已被選作制備生物仿生復合膜的候選蛋白之一。但是缺乏有效手段獲得足夠量的AqpZ蛋白樣品已成為該技術的主要瓶頸之一。主要由于AqpZ蛋白強烈的疏水性，它在細胞內的大量表達會造成細胞毒性，影響宿主細胞的正常代謝，因此其表達水平受到大大的限制，AqpZ在大腸桿菌體系的表達量僅僅只有2.5?mg/L。有研究表明采用融合表達策略可以大大提高AqpZ的表達水平，但是大部分蛋白都是以包涵體形式存在，仍然不能大量獲得具有生物功能的AqpZ。主要的原因是親水性標簽還不能夠完全中和AqpZ強烈的疏水性。因此，很難滿足結構學研究和制備基于水通道蛋白的水回收裝置的要求。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種水通道蛋白AqpZ的制備方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種水通道蛋白AqpZ的制備方法，它包括以下步驟：

（1）大腸桿菌水通道蛋白AqpZ-HIS的擴增：根據NCBI上的大腸桿菌水通道蛋白基因序列設計2對引物，通過設計引物在AqpZ基因的3'端人為的添加8個HIS親和標簽，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示；根據pMAL-p2和pMAL-c5e這兩個載體的多克隆位點特點，在第一引物的上下游分別加上Bam?HI和Sal?I限制性內切酶位點以適用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分別加上Bam?HI和Hind?III限制性內切酶位點以適用于pMAL-c5e，利用聚合酶鏈式反應，得到帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA

（2）重組表達載體的構建：將步驟1得到的帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同樣的內切酶雙酶切過的表達載體pMAL-p2和pMAL-c5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元標簽重組表達載體pMAL-p2-AqpZ-HIS及?pMAL-c5e-AqpZ-HIS；將這兩個二元標簽重組表達載體化到大腸桿菌DH5α感受態中，然后，涂布在含氨芐霉素的LB平板上，培養過夜，隨機挑取平板上生長的菌落，堿法抽提質粒DNA，進行雙酶切和測序鑒定；