[發(fā)明專利]影響經(jīng)典Wnt信號途徑的藥物的篩選方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310074003.5
• 申請日: 2013-03-07
• 公開（公告）號: CN104034856A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李林;汪勝;郝小江;宋曉敏;尹俊林;陳鐸之
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;中國科學(xué)院昆明植物研究所
• 主分類號: G01N33/15
• 分類號: G01N33/15
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種影響經(jīng)典Wnt信號途徑的藥物的篩選方法，以Axin與LRP5/6相互作用作為篩藥靶點(diǎn)。

2.如權(quán)利要求1所述的藥物的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法具體包括下列步驟：

1）初篩：將備選藥物作用于Axin和LRP5/6的復(fù)合物，并檢測被處理后的Axin和LRP5/6的復(fù)合物的變化情況，選擇能影響Axin和LRP5/6的復(fù)合物的藥物作為初篩藥物；

2）構(gòu)建表達(dá)經(jīng)典Wnt信號途徑報(bào)告基因的細(xì)胞，將初篩藥物作用于表達(dá)經(jīng)典Wnt信號途徑報(bào)告基因的細(xì)胞，考察初篩藥物對經(jīng)典Wnt信號途徑報(bào)告基因表達(dá)活性的影響，篩選出能影響經(jīng)典Wnt信號途徑報(bào)告基因表達(dá)活性的藥物；

3）選出滿足以下任一條件的藥物作為篩選的陽性藥物：

a)該藥物在步驟1）中能夠增強(qiáng)Axin和LRP5/6的復(fù)合物的形成，并且該藥物在步驟2）中能夠提高Wnt報(bào)告基因的表達(dá)；

b)該藥物在步驟1）中能夠抑制Axin和LRP5/6的復(fù)合物形成的，并且該藥物在步驟2）中能夠抑制Wnt報(bào)告基因的表達(dá)。

3.如權(quán)利要求2所述的藥物的篩選方法，其特征在于，所述步驟1）中，將備選藥物作用于Axin和LRP5/6的復(fù)合物，并檢測被處理后的Axin和LRP5/6的復(fù)合物的變化情況的方法具體包括下列步驟：在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Axin，GSK3α/β，MESD和LRP5/6的質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入特定濃度的備選藥物，作用一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，用裂解細(xì)胞液做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)沉淀Axin與LRP5/6的復(fù)合物，再利用Western?Blot檢測Axin與LRP5/6的復(fù)合物的量是否受備選藥物影響。

4.如權(quán)利要求3所述的藥物的篩選方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞選自HEK293T、HEK293、NIH3T3、Hela和MEF。

5.如權(quán)利要求2所述的藥物的篩選方法，其特征在于，所述步驟2）包括：

a)用含經(jīng)典Wnt信號途徑報(bào)告基因的質(zhì)粒和含內(nèi)標(biāo)GFP的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

b)加入含有初篩藥物的對照培養(yǎng)基或含有初篩藥物的Wnt3a條件培養(yǎng)基作用于細(xì)胞特定時(shí)間；

c)收集細(xì)胞，測定細(xì)胞裂解液中的GFP蛋白的熒光和熒光素酶的活性；

d)用GFP的熒光量使熒光素酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化，篩選出能影響經(jīng)典Wnt信號途徑報(bào)告基因活性的藥物。

6.如權(quán)利要求5所述的藥物的篩選方法，其特征在于，所述含經(jīng)典Wnt信號途徑報(bào)告基因的質(zhì)粒為TOPFlash質(zhì)粒。

7.如權(quán)利要求5所述的藥物的篩選方法，其特征在于，步驟a）所用細(xì)胞選自HEK293T、HEK293、NIH3T3、Hela和MEF。

8.如權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述藥物的篩選方法的用途，為將所述藥物的篩選方法用于下列任一類藥物的篩選：

a)預(yù)防或治療由經(jīng)典Wnt信號途徑異常所引起的疾病或失調(diào)的藥物;

b)需要特異性激活或抑制經(jīng)典Wnt信號途徑的疾病或失調(diào)的藥物;

c)干細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增藥物。

9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述疾病或失調(diào)為癌癥、老年癡呆癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥或造血干細(xì)胞移植。

10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌癥為結(jié)腸癌。

11.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，將所述藥物的篩選方法用于下列任一種藥物的篩選：抗癌藥物、老年癡呆癥藥物、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物、骨質(zhì)疏松癥藥物、造血干細(xì)胞移植藥物、干細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增藥物、斑馬魚發(fā)育調(diào)控藥物或骨發(fā)育調(diào)控藥物。