[發(fā)明專利]斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白基因、載體、重組菌株和蛋白及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310073460.2
• 申請(qǐng)日: 2013-03-07
• 公開（公告）號(hào): CN103172722A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王維娜;羅盛偉;祁增華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/46
• 分類號(hào): C07K14/46;C12N15/12;C12N15/63;C12N15/81;A61K38/17;A61P37/04;A23K1/16;A23K1/18;C12R1/84
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 張海文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程研發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白以及編碼該蛋白的基因，包含該基因的載體以及該蛋白的應(yīng)用。

背景技術(shù)

鈣調(diào)蛋白（CaM）是Ca²⁺信號(hào)通路中的重要調(diào)控蛋白之一。Ca²⁺作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，在行使其傳遞信息流作用中，要依賴于鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白的相互作用，其中，鈣調(diào)蛋白是在真核細(xì)胞中廣泛分布的。于1964年，美籍華人張槐耀對(duì)胞內(nèi)cAMP的相關(guān)研究工作中發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白的存在。鈣調(diào)蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)，是一種酸性的單鏈蛋白，兩端各包含有兩個(gè)高度保守的Ca²⁺結(jié)合區(qū)域，每個(gè)Ca²⁺結(jié)合區(qū)域能夠結(jié)合一分子的Ca²⁺，中間由α螺旋結(jié)構(gòu)相連，其分子量一般在1.7KDa，約由149個(gè)氨基酸組成。在其氨基酸組成當(dāng)中，酸性氨基酸占了約30%，從而能夠提供羧基（-COOH）與鈣離子結(jié)合。在功能上，鈣調(diào)蛋白單體一般以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激以后，能夠迅速捕獲胞質(zhì)內(nèi)的Ca²⁺，從而引起自身的構(gòu)象發(fā)生改變，形成具有高度活性的Ca²⁺-CaM復(fù)合物，由于在其氨基酸組成中不包含有羥脯氨基酸，從而保證了肽鏈的高靈活性，作用于靶酶的激活位點(diǎn)，引起其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使后者從非活性態(tài)轉(zhuǎn)變成活性態(tài)。靶酶被激活后，又會(huì)作用于下游的關(guān)鍵因子，進(jìn)一步在逆境中調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝，在增強(qiáng)魚類自身免疫能力的方面，對(duì)機(jī)體的免疫防御發(fā)揮出重要的作用。

斜帶石斑魚（Epinepheluscoioides）屬于鱸形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，石斑魚亞科(Epinephelinae)，石斑魚屬(Epinephelus)，是暖水性的礁棲魚類，在印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域廣泛分布。石斑魚屬于名貴海產(chǎn)魚類之一，其肉質(zhì)鮮美，倍受各地消費(fèi)者的喜愛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值巨大。但是，由于面對(duì)著目前的急劇的氣候變化災(zāi)害和嚴(yán)重污染的水質(zhì)問題，從而導(dǎo)致了其致病率和死亡率居高不下，對(duì)石斑魚的人工養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)打擊，也是一個(gè)難以解決的問題。如何增強(qiáng)石斑魚的抗逆能力，提高養(yǎng)殖存活率，是目前亟待解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有問題，本發(fā)明的目的在于提供一種斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白、該蛋白的編碼基因、以及該蛋白的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，或者是SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。

編碼上述斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

一種克隆載體，其含有斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白基因。

一種表達(dá)載體，其含有斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白基因。

生產(chǎn)斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白的方法，包括將含有斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白基因的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，表達(dá)得到斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白。

所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母。

斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白在制備水產(chǎn)動(dòng)物免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明首次獲得了斜帶石斑魚的鈣調(diào)蛋白CaM基因序列，可以應(yīng)用于制備重組蛋白、魚類免疫制劑和飼料添加劑，為斜帶石斑魚的生理免疫研究提供了新的實(shí)踐基礎(chǔ)；

（2）本發(fā)明所提供的斜帶石斑魚CaM重組蛋白，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明可以提高石斑魚抗應(yīng)激能力，可以應(yīng)用于制備與魚類相關(guān)的免疫制劑或飼料添加劑，具有廣闊的應(yīng)用潛力；

（3）將斜帶石斑魚CaM核苷酸序列在巴斯德畢赤酵母重組菌株中表達(dá)，可以應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化生存，降低了成本的投入，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是斜帶石斑魚CaM基因ORF的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖；

圖2是石斑魚CaM基因ORF連接酶切接頭（EcoRI?、XbaI）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖；

圖3是克隆載體pMD18-T-CaM雙酶切（EcoRI?、XbaI）和表達(dá)載體pPICZaA雙酶切（EcoRI?、XbaI）的電泳鑒定圖；

圖4是pPICZaA表達(dá)載體和所構(gòu)建的pPICZaA-CaM表達(dá)載體單酶切（Sacl）的電泳鑒定圖；