[發明專利]PCR酶切分型快速鑒定土壤和環境水中軍團菌的方法

有效

• 申請號: 201310072966.1
• 申請日: 2013-03-07
• 公開（公告）號: CN103509854A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 趙利偉;胡朝暉;朱慶義;顧全
• 申請（專利權）人: 廣州金域醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種PCR酶切分型快速鑒定土壤和環境水中軍團菌的方法，其特征在于步驟如下：

（1）針對軍團菌特異位點設計并合成一對引物；

（2）配制CTEN基因組DNA提取液；

（3）提取DNA；

（4）PCR擴增；

（5）瓊脂糖凝膠電泳；

（6）酶切分析。

2.權利要求1所述的方法，其中針對軍團菌特異位點設計的引物中：

上游引物為Leg?557F，其序列為SEQ?ID?NO：1，

下游引物為Leg?557R，其序列為SEQ?ID?NO：2。

而且其中，

（2）中的CTEN基因組DNA提取液成分為：

Chelex-100溶液??5%

三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽??10mM

乙二胺四乙酸二鈉??0.1mM

疊氮鈉??0.1%

蛋白酶K??100μg/ml；

（3）DNA提取的具體步驟為：

樣本離心沉淀后，于沉淀物種中加入CTEN基因組DNA提取液60μl，充分混勻，55℃水浴30min，100℃水浴10min，離心后，上清液即是提取的基因組DNA模板；

（4）PCR擴增的具體步驟為：

PCR反應體系為上游引物和下游引物各1μl，PCR?Master?Mix?12.5μl，雙蒸水?5.5μl，基因組DNA模板5μl，總體系25μl；

PCR反應條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，進行30～40個循環；72℃保溫5min

（5）瓊脂糖凝膠電泳的具體步驟為：

取PCR擴增產物5μl經瓊脂糖凝膠電泳，如有557bp條帶出現則認為軍團菌陽性，反之，則認為軍團菌陰性；

（6）酶切分析的具體步驟為：

取上述（5）陽性PCR產物10μl于PCR管中，加入2μl?10×Buffer，1μl限制性內切酶FastDigest?HinfⅠ酶，用17μl雙蒸水補足至30μl，37℃水浴5min后，取8μl?PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳進行分析；嗜肺軍團菌可被消化為400bp和157bp片段，而非嗜肺軍團菌中的阿德萊德軍團菌、釜山軍團菌和倫敦軍團菌可被消化為約257bp和150bp片段，其他非嗜肺軍團菌不被消化，仍為557bp，據此可區分鑒別嗜肺軍團菌。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶切反應使用的限制性內切酶為限制性核酸內切酶HinfⅠ的同裂酶，即識別位點為“GANTC”的所有內切酶。