[發明專利]表達 PCV2密碼子優化ORF1和ORF2串聯基因的重組病毒

無效

• 申請號: 201310072686.0
• 申請日: 2013-03-07
• 公開（公告）號: CN103275937A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 王小敏;何孔旺;汪偉;周忠濤;俞正玉;倪艷秀;溫立斌;張雪寒;郭容利;呂立新;李彬;周俊明;茅愛華;葉青;周萍;沈江萍
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;C12N15/866;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發明涉及一種表達PCV2密碼子優化ORF1和ORF2串聯基因的重組病毒，屬于生物工程領域，具體地說，涉及豬圓環病毒ORF1和ORF2密碼子的優化、優化序列重組桿狀病毒的獲得及其制備的基因工程疫苗，屬于基因工程疫苗領域。?

二、背景技術

豬圓環病毒病（PCVD）是由豬圓環病毒2型（PCV2）引起的豬傳染性疾病，是豬的重要免疫抑制性疾病之一，該病已給全球養豬業造成了巨大的經濟損失。眾多學者認為，豬圓環病毒病會引起斷奶后仔豬多系統衰弱綜合征(PMWS)及豬皮炎腎病綜合征(PDNS)，同時還能引起母豬繁殖障礙、新生仔豬先天性震顫(CT)等疾病，也是豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)的原發病原之一。目前，國內外豬場普遍存在PCV2感染，我國自2000年報道PCV2感染的血清學證據以來，流行范圍已波及全國，豬群平均陽性率最高高達60%，發病豬死亡率為10%-30%不等，較嚴重的豬場在爆發本病時死亡率高達40%，危害日益嚴重。?

目前，如何有效防控PCVD已成為全球養豬業關注的焦點。疫苗預防接種是控制本病的最有效手段，國內外研究者也在豬圓環病毒病疫苗研制方面開展了較多工作。首先是全病毒滅活疫苗，目前國內外都有注冊的滅活疫苗，但總體而言，滅活疫苗對機體刺激時間比較短，需多次接種，而且PCV2在細胞上增殖滴度低，其制備費用遠遠高于其他疾病的滅活疫苗，且無法鑒別疫苗免疫與野毒感染，同時由于PCV2抵抗力強，普通滅活劑很難確保能徹底滅活病毒，存在潛在的生物安全風險；其次是亞單位疫苗，相對于其他疫苗，亞單位疫苗產生抗體更早，抗體水平穩定，能夠有效阻止病毒的復制，保護力強，目前國外利用桿狀病毒表達的Cap蛋白的亞單位疫苗已有注冊，FortM等研究也表明該疫苗使用劑量相對較少，免疫效果好，對歐洲及北美的PCV2控制發揮了巨大作用；再次是減毒活疫苗，FenauxM等學者發現了PCV2的致弱位點，為減毒活疫苗的研制提供了方向，該疫苗雖然能夠誘導很好的免疫應答，但長期使用存在反強的危險；另外也有學者對其活載體疫苗、核酸疫苗等進行研究，但都沒有獲得成品。眾多研究表明，PCV2疫苗的研制方向應該是基因工程疫苗，尤其是亞單位疫苗。?

目前國外勃林格殷格翰動物保健公司的PCV2疫苗(CircoFlex)已在我國上市，2010年國內由姜平等和劉長明等研發的豬圓環病毒2型滅活疫苗，圓健-SH株和LG株也相繼上市。國外疫苗價格十分昂貴，國內滅活疫苗又基于細胞增殖病毒，因PCV2在細胞上增殖滴度低、生產活疫苗和滅活疫苗費時又費力。因而在PCV2流行逐年上升，流行范圍逐步擴大，各成長階段的豬感染嚴重、混合感染突出、給全國養豬業造成了巨大損失的情況下，如何研制出一種免疫原性好、可以高效生產、價格合適的新型可商品化基因工程疫苗已成為當務之急。?

PCV2主要編碼3個閱讀框，ORF1編碼與復制相關的蛋白即Rep蛋白；ORF2編碼病毒的主要結構蛋白即Cap蛋白，是PCV2的主要免疫原；ORF3編碼的蛋白與細胞凋亡有關。目前，由于Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白，因而基于Cap蛋白的表達以研制成疫苗的研究成為熱點。桿狀病毒表達系統以其表達外源性蛋白產量高、抗原性好、產物易純化等優點，在眾多疫病的研究中得到廣泛應用。目前研究表明，利用桿狀病毒表達Cap蛋白能夠自我組裝成類病毒粒子，且劉長明、FortM等研究表明，桿狀病毒表達Cap蛋白具有很好的免疫原性。Maria?Fort等研究顯示PCV2的Cap蛋白和Rep蛋白都參與了PCV2感染后所介導的細胞免疫。最近又有研究表明，PCV2ORF2與ORF1串聯的核酸疫苗、ORF1-2重組腺病毒免疫效果較單獨的ORF1/ORF2核酸疫苗或ORF1、ORF2重組腺病毒顯得更為優越。因而本發明，將ORF1和ORF2串聯表達，以獲得更好的免疫原性。?

目前，我國關于PCV2相關研究的報道，尤其是遺傳變異情況的報道不斷增多。有報道表明在中國，PCV2a可細分為2A、2D、2E亞型，PCV2b可細分為1A/1B、1C亞型，還可能存在既非PCV2a又非PCV2b的亞型PCV2c；溫立斌等利用RFLP分析技術可將我國流行毒株分為9種基因型，即CHN-2A、CHN-2B、CHN-2C、CHN-2D、CHN-2E、CHN-2F、CHN-2G、CHN-2H和CHN-2I。可見我國PCV2存在基因多樣性，因而根據單一的PCV2序列設計的疫苗無法對所有PCV2亞型提供很好的交叉保護。因此本研究將已知的PCV2基因進行系統進化樹分析，取其一致序列（Consensus?sequence），提高其交叉保護性。?