[發明專利]用于同時檢測沙門菌枸櫞菌變形菌和愛德華菌的多重PCR引物及其設計方法

有效

• 申請號: 201310072599.5
• 申請日: 2013-03-06
• 公開（公告）號: CN103146827A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 陳瓊;孔繁德;徐淑菲;趙冉;周昱;楊濤;陳永鋒;連玉華
• 申請（專利權）人: 廈門市農產品質量安全檢驗測試中心;廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的檢測，尤其是涉及一種用于同時檢測沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物及其設計方法。

背景技術

沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌、遲緩愛德華菌均屬于腸桿菌科，可通過食物、傷口傳播。除了引起食物中毒還能引起人和動物機體的多系統感染。

沙門氏菌為腸桿菌科細菌較早的成員，具有呼吸和發酵兩種代謝類型，存在于溫血及冷血動物體內、食物和環境中，是一種常見的病原菌，可以引起傷寒、腸傷寒、胃腸炎和敗血癥等相關疾病。沙門菌的血清型很多，給鑒定帶來很大困難。沙門菌在自然界分布比較廣泛，在外界環境中能生存較久，在水和土壤中能生存數周到數月，在冰庫中甚至能存活半年以上。近年來，由于抗生素的濫用，該菌對氯霉素的耐藥菌株明顯增多，有的菌株對慶大霉素、卡那霉素、氨芐青霉素等也耐藥，這使得食品安全中對該菌的檢測投入了大量的人力物力。

弗氏枸櫞酸桿菌，也被稱為弗氏檸檬酸桿菌。曾被歸于埃希菌屬。檸檬酸桿菌屬的細菌，具有如腸桿菌科的菌體、表面和鞭毛的相應抗原，有研究表明，檸檬酸桿菌中許多血清型的抗原與沙門菌屬和埃希菌屬的抗原有關，這個也給常規鑒定帶來了一定困難。弗氏枸櫞酸桿菌在自然界廣泛分布，是人和多種動物包括哺乳類、鳥類、爬行類和兩棲類的腸道常在菌，常見于糞便和被糞便污染的地方，也常見于土壤、水體和食物中，所以該菌也列在了大腸菌群。作為環境和食品等的糞源污染的衛生細菌學指標。該屬的細菌作為人的條件致病菌，看在社區或者醫院內發生感染，大多數感染部位是尿路和呼吸道，還可引起敗血癥、腦膜炎、骨髓炎、中耳炎及心內膜炎，在一定的數量下，還能引起食物中毒。對動物的致病性有明確記述的主要是魚類，最近也有甲殼類和爬行類感染的報道，死亡率較高，對水產養殖影響不小，當前分子生物學鑒定還局限于對該菌的16SrRNA基因序列測定與系統發育學分析，時間周期太長，無法應用于日常監測和檢測。

奇異變形桿菌亦被稱作奇異桿菌，是變形桿菌屬中較早的成員，對人類可引起原發性或繼發性感染，也可以導致人類食物中毒，對動物也有致病作用。該屬的細菌廣泛存在于自然界中，尤其以奇異變形桿菌更為常見，它是一種已被確定的病原菌，或是單獨或是與其他病原菌混合感染引起人的不同類型感染癥，也是人尿路感染的一種主要病原，有的菌株還引起食物中毒，在呼吸道、消化道以及燒傷創面感染中的檢出率也不斷增加，是一種常見的醫院感染菌。最重要的是，奇異變形桿菌能產生耐熱腸毒素，引起相應的胃腸炎性食物中毒。

遲緩愛德華菌在試愛德華均屬細菌中最早的成員，該菌能在特定條件下引起人的多種類型感染，也是魚類常見的病原細菌，廣泛存在于自然界中，此菌多從腹瀉病人的糞便中分離到，而在健康人群的糞便中是極少分離到的。遲緩愛德華菌還能引起人的腦膜炎、腹膜炎、菌血癥、敗血癥、皮膚軟組織感染，發生腸道感染的臨床表現類似沙門氏菌，雖然該菌被認定為人、魚共染病原菌，但是主要發生在魚類，甲殼類也是常見宿主，對養殖產業造成巨大影響。

目前，國內對沙門菌的檢測已經有了相應的國家標準，分為以下幾個過程:(1)前增菌；(2)選擇性增菌；(3)選擇性培養；(4)生化鑒定；(5)血清學實驗。但國標方法步驟繁瑣，費時費力，重復性不好，且弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的檢測還沒有建立相應的標準。因此，建立簡便、快速、準確、可靠、的檢測方法同時適用于這四種的檢測，彌補目前檢測方法的不足尤為重要。

多重PCR技術的應用，可大大減少檢測成本，可大大減少工作量，適應于口岸快速檢測的需要，是一種準確、可靠、科學的分子生物學方法。有鑒于此，盡快開發一種用于同時檢測沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR勢在必行。