[發(fā)明專利]鼠肝炎冠狀病毒的GFP示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310072395.1
• 申請日: 2013-03-07
• 公開（公告）號: CN103146656A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉京梅;常國輝;孫走南;柳洪濤;戶義;吳曉燕;張雨;楊益;蘇文莉;何湘
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/63;A01K67/027;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鼠肝炎冠狀病毒的GFP示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用，特別涉及一種在野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株基因組中插入GFP后得到的重組鼠肝炎冠狀病毒。

背景技術(shù)

冠狀病毒是目前已知的基因組最大的單股正鏈RNA病毒，主要引起呼吸道和消化道的疾病，是多種經(jīng)濟(jì)動物傳染性疾病的病原體，常常導(dǎo)致巨大的社會經(jīng)濟(jì)損失。自2003年一種新的SARS-CoV被確定為烈性傳染病SARS的病原體以來，冠狀病毒（Coronavirus）便成為全球生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

綠色熒光蛋白（green?fluorescent?protein，GFP）是來源于發(fā)光水母（aequorea?victoria）的一種功能獨(dú)特的蛋白質(zhì)，分子量為27kD，由238個(gè)氨基酸組成。自1992年P(guān)rasher等克隆到GFP的cDNA以來，GFP示蹤技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。結(jié)合GFP熒光示蹤的技術(shù)手段，可分別在細(xì)胞和動物水平，對標(biāo)記分子或物質(zhì)進(jìn)行熒光示蹤監(jiān)測和定量檢測。

目前尚未有對鼠肝炎冠狀病毒進(jìn)行GFP示蹤的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種鼠肝炎冠狀病毒的GFP示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用。所述鼠肝炎冠狀病毒的GFP示蹤系統(tǒng)即為一種表達(dá)綠色熒光蛋白的重組鼠肝炎冠狀病毒。

本發(fā)明所提供的重組鼠肝炎冠狀病毒，是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進(jìn)行替換或插入得到的重組病毒；

所述替換為：將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的片段a中的任一片段（可由1個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)核糖核苷酸組成）替換為片段b；

所述插入為：在所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的所述片段a中的任一位點(diǎn)處插入所述片段b；

所述片段a為序列表中序列1編碼的RNA；所述片段b為含有綠色熒光蛋白編碼基因的DNA片段編碼的RNA。

所述綠色熒光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

在本發(fā)明中，所述綠色熒光蛋白的編碼基因的序列為序列表中序列3的第142-861位。

進(jìn)一步，所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述野生型鼠肝炎冠狀病毒具體為鼠肝炎冠狀病毒A59株。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組鼠肝炎冠狀病毒是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進(jìn)行替換得到的重組病毒；具體的，所述替換中，所述“片段a中的任一片段”為所述片段a中的序列1的第468-765位核苷酸對應(yīng)的RNA片段。

由于所述野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA序列為GenBank號為NC_001846.1的序列（Up?date：2012-8-23），相應(yīng)的，所述重組鼠肝炎冠狀病毒的基因組RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA序列為GenBank號為NC_001846.1的序列（Up?date：2012-8-23）的第27967-28264位（對應(yīng)序列1的第468-765位）替換為序列表中序列3，得到的核苷酸序列。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法。

本發(fā)明所提供的制備所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法具體可包括如下步驟：

（a）將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列分別克隆至質(zhì)粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質(zhì)粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)位于序列1中；

（b）用含所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA序列的痘苗病毒載體甲感染CV-1細(xì)胞后，用步驟（a）獲得的重組質(zhì)粒甲轉(zhuǎn)染所述CV-1細(xì)胞，所述痘苗病毒載體甲與所述重組質(zhì)粒甲通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列發(fā)生同源重組，獲得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒載體甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒載體甲中的所述待插入位點(diǎn)處插入所述gpt基因的重組痘苗病毒載體乙；

（c）將步驟（b）中的所述重組痘苗病毒載體乙中的所述gpt基因替換為所述含有綠色熒光蛋白的編碼基因的DNA片段，得到重組質(zhì)粒乙；