[發(fā)明專利]制備模塊融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310072134.X
• 申請日: 2006-10-19
• 公開（公告）號: CN103215294A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: T·里德
• 申請（專利權(quán)）人: 英特瑞克斯頓股份有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/US2006/060065，國際申請日為2006年10月19日，進(jìn)入中國國家階段的申請?zhí)枮?00680038790.6，名稱為“制備模塊融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。

本申請的主題涉及申請?zhí)?0/728,259，60/803,913，60/821,682，60/821,958，10/682,764(US2004/0185556，PCT/US2004/013517，WO2005/040336)，11/233,246和US20040572011P(WO2005116231)。這些專利和申請各自通過引用納入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)方法和實(shí)施該方法的產(chǎn)品。更具體地說，本發(fā)明涉及編碼模塊型蛋白質(zhì)的核酸的克隆方法，所述模塊可順序加入預(yù)定位置。

背景技術(shù)

本領(lǐng)域已知克隆核酸的重組DNA技術(shù)和分子生物學(xué)方法。這種方法包括利用限制性內(nèi)切酶、連接酶、核苷酸/核苷激酶和磷酸酶、聚合酶及其它分子生物學(xué)工具操作核酸，從而產(chǎn)生所需的重組核酸。已出版的幾種實(shí)驗(yàn)室手冊可以作為分子生物學(xué)研究者的參考書籍。這些參考手冊的例子包括：Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular?Cloning:A?Laboratory?Manual)，第二版，冷泉港，紐約：冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社；Joseph?Sambrook和David?Russell，2001，《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular?Cloning:A?Laboratory?Manual)，第三版，冷泉港，紐約：冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社。

本領(lǐng)域的問題之一是缺乏方法來工程改造嵌合蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物，而能方便地將模塊元件插入嵌合體內(nèi)所需位置。總之，雖然已成功制備了雜交或嵌合蛋白質(zhì)，但合成的目的是為在終產(chǎn)物(不想局限于預(yù)定的機(jī)制)中加入更多的模塊。本發(fā)明的一方面考慮到嵌合體及其變體的未來需求和能制備它們而無需每個都從頭開始以解決該問題。本發(fā)明的一個實(shí)施方式總體上涉及制備融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的方法。本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及含有預(yù)先經(jīng)工程改造的模塊型融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的制備方法。本發(fā)明另一方面涉及構(gòu)建區(qū)段分子或模塊，這種模塊預(yù)先設(shè)計(jì)成能插入嵌合蛋白質(zhì)表達(dá)盒。本發(fā)明還涵蓋了可用于所披露方法的工程改造模塊的文庫。一個實(shí)施方式制備了含有預(yù)定限制性位點(diǎn)的模塊。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及制備模塊型嵌合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的方法和該方法所用的組合物。具體地說，本發(fā)明涉及順次、定向克隆編碼多肽模塊的多核苷酸。各可克隆元件含有側(cè)接預(yù)定的限制性位點(diǎn)的開放讀框。這些方法包括利用可克隆元件和含有這些元件的載體作為重組DNA技術(shù)的起始材料。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是能快速而方便地制備許多融合蛋白變體，而無需設(shè)計(jì)和評估后續(xù)的各克隆步驟。

本發(fā)明的一個實(shí)施方式通常涉及制備融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的方法。本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及含有組合模塊的融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的制備方法。本發(fā)明另一方面涉及構(gòu)建嵌段分子或模塊，這種模塊預(yù)先設(shè)計(jì)成能插入嵌合表達(dá)盒。本發(fā)明還涵蓋了可用于所披露方法的模塊文庫。一個實(shí)施方式制備了含有預(yù)定限制性位點(diǎn)的模塊。

各可克隆元件或模塊含有編碼感興趣開放讀框，例如但不限于：全長蛋白質(zhì)或多肽、或功能域、結(jié)構(gòu)域、酶結(jié)構(gòu)域、抑制區(qū)、結(jié)合區(qū)、定位信號、表位、外顯子、或其它所需的亞成分的多核苷酸序列。可從國家醫(yī)藥圖書館獲得有關(guān)模塊蛋白質(zhì)信息的數(shù)據(jù)庫，其稱為保守性結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫或CDD，該數(shù)據(jù)庫代表了可根據(jù)蛋白質(zhì)家族和物種之間保守的氨基酸序列同源性來鑒定結(jié)構(gòu)域的一種來源。

全長蛋白質(zhì)的非限制性例子包括激酶、激酶亞基、磷酸酶、磷酸酶亞基、肽配體、蛋白酶、蛋白酶亞基、酶亞基、DNA結(jié)合蛋白亞基、g-蛋白亞基、離子通道亞基和膜受體亞基，僅是舉例。

功能域的非限制性例子包括DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、二聚體化功能域、催化域、磷酸化區(qū)、調(diào)節(jié)區(qū)、死亡結(jié)構(gòu)域、普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域、脂質(zhì)結(jié)合區(qū)、激素結(jié)合區(qū)、配體結(jié)合區(qū)、鋅指區(qū)、亮氨酸拉鏈區(qū)、g-蛋白結(jié)合區(qū)、糖基化區(qū)、酰化區(qū)和跨膜區(qū)，僅是舉例。

結(jié)構(gòu)域的非限制性例子包括α螺旋區(qū)、β片尾區(qū)、酸性區(qū)、堿性區(qū)、疏水區(qū)、鏈內(nèi)二硫鍵區(qū)(intra-chain?disufide?bonding?domain)、輔因子結(jié)合區(qū)和金屬離子結(jié)合區(qū)，僅是舉例。