[發(fā)明專利]MgCl2脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310072024.3
• 申請日: 2013-03-07
• 公開（公告）號: CN103146661A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?zhí)m威;張莉麗;張英春;杜明;馮鎮(zhèn);單毓娟;韓雪;易華西;焦月華;李洪波
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12R1/465
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，采用茂原鏈霉菌為發(fā)酵菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MgCl₂，發(fā)酵96?h提高鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1-0.2?mol/L的MgCl₂。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的具體步驟如下：

用5mL無菌生理鹽水將培養(yǎng)7d的斜面孢子洗下，接種于100mL種子培養(yǎng)基中，30℃、200r/min培養(yǎng)48h后，按10%的接種量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1-0.2?mol/L?MgCl₂，30℃、200r/min條件下采取提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾器過濾或壓濾，再經(jīng)0.22?μm濾膜的微過濾裝置過濾，制成無細(xì)胞的酶液，添加經(jīng)烘干滅菌的載體保護(hù)劑充分混溶，制成干粉或醫(yī)藥級酶制劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述載體保護(hù)劑為以無細(xì)胞的酶液計(jì)蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述載體保護(hù)劑經(jīng)100℃、1小時(shí)烘干滅菌，無菌條件下與無細(xì)胞的酶液充分混溶。

6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述保護(hù)劑與無細(xì)胞酶液充分混溶，再經(jīng)0.22?μm濾膜的微過濾裝置過濾除菌。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于采用低溫噴霧干燥或冷凍干燥制成干粉。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述低溫噴霧干燥的條件為進(jìn)風(fēng)溫度80℃，出風(fēng)溫度55-?60℃；冷凍干燥采用真空冷凍干燥機(jī)干燥，凍干機(jī)冷井溫度為-60℃，真空度為0.05MPa。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于通過超濾、凝膠層析、離子交換層析、透析后再經(jīng)凍干制成醫(yī)藥級酶制劑。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的MgCl₂脅迫提高茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述制備醫(yī)藥級酶制劑的具體要求如下：

（1）超濾：

將上述的無細(xì)胞酶液進(jìn)行超濾，超濾條件為采用截流分子量為30kDa的超濾膜，將無細(xì)胞的酶液濃縮為初始體積的1/5；

（2）凝膠層析：

將濃縮液加入到預(yù)先用50?mmol/L、pH?6.0磷酸鹽緩沖液平衡的Sephadex?G75層析柱中，并用相同緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0.25?mL/min，檢測波長為了280nm，收集有活性的部分；

（3）離子交換層析：

將收集到的全部活性部分加入到預(yù)先用50?mmol/L、pH?6.0磷酸鹽緩沖液平衡的SP?sepharose?High?Performance層析柱中，用含0-0.25mol/L氯化鈉的相同緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為3?mL/min，檢測波長為了280nm，收集活性部分。