[發(fā)明專利]一種利用熒光探針檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310071889.8
• 申請日: 2013-03-06
• 公開（公告）號: CN104031979B
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設計）人: 王樹
• 申請（專利權(quán)）人: 常州欣宏科生物化學有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 常州佰業(yè)騰飛專利代理事務所(普通合伙)32231
• 代理人: 金輝

1.一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于：依次包括以下步驟：

1)以待測樣本的DNA為模板進行PCR擴增，并用熒光物質(zhì)標記待測樣本的DNA；

2)通過所述熒光物質(zhì)與下述式(I)的化合物熒光共振能量轉(zhuǎn)移情況確定所述待測DNA的目標單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸；所述熒光物質(zhì)的吸收光譜與所述式(I)的化合物發(fā)射光譜在8.0×10^-16～5.0×10^-13M^-1cm³有重疊

式(I)中，R為6-三甲胺基己基，X代表鹵素；所述式(I)化合物的數(shù)均分子量為5000-20000，所述方法用于非疾病診斷和治療的目的。

2.如權(quán)利要求1所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于：所述式(I)中，X為氯、溴和碘中的任意一種。

3.如權(quán)利要求1中所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于：所述用熒光物質(zhì)標記步驟1)的DNA的方法為：用熒光物質(zhì)標記的dNTP或ddNTP對PCR擴增產(chǎn)物進行單堿基延伸；所述dNTP或ddNTP為與所述目標單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸相鄰的一個核苷酸互補的dNTP或ddNTP。

4.如權(quán)利要求3所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于：所述單堿基延伸中，所用的引物有兩種：野生型特異性引物和突變型特異性引物；所述野生型特異性引物的末端核苷酸與所述目標單核苷酸多態(tài)位點的野生型核苷酸互補；所述突變型特異性引物的末端核苷酸與所述目標單核苷酸多態(tài)位點的突變型核苷酸互補；所述引物能與目標單核苷酸多態(tài)位點相鄰20-25bp的序列互補。

5.如權(quán)利要求4所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測 方法，其特征在于：確定所述待測DNA的目標單核苷酸多態(tài)位點核苷酸的方法為：若只在使用野生型特異性引物時出現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為野生純合型；若只在使用突變型特異性引物時出現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為突變純合型；若使用兩種引物都出現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為雜合型。

6.如權(quán)利要求1中所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于：所述用熒光物質(zhì)標記步驟1)的DNA的方法為：用熒光物質(zhì)A標記與所述目標單核苷酸多態(tài)位點的野生型核苷酸互補的dNTP或ddNTP，用熒光物質(zhì)B標記與所述目標單核苷酸多態(tài)位點的突變型核苷酸的互補dNTP或ddNTP，用所述熒光物質(zhì)A標記的dNTP或ddNTP和熒光物質(zhì)B標記的dNTP或ddNTP同時對PCR擴增產(chǎn)物進行單堿基延伸；在同一激發(fā)光的作用下，所述熒光物質(zhì)A和所述熒光物質(zhì)B產(chǎn)生的熒光的波長至少相差50nm。

7.如權(quán)利要求1所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于：確定所述待測DNA的目標單核苷酸多態(tài)位點核苷酸的方法為：若單獨出現(xiàn)式(I)的化合物到熒光物質(zhì)A的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為野生純合型；若單獨出現(xiàn)式(I)的化合物到熒光物質(zhì)B的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為突變純合型；若兩種熒光共振能量轉(zhuǎn)移都出現(xiàn)，則所述待測DNA的目標單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為雜合型。

8.如權(quán)利要求1中所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于：所述熒光物質(zhì)為熒光素、羅丹明、溴乙啶、Cy3或Cy5。