[發明專利]一種濁點系統中轉化植物甾醇為雄烯二酮的方法

在審

• 申請號: 201310071774.9
• 申請日: 2013-03-06
• 公開（公告）號: CN104031969A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 曾俊華;張保國
• 申請（專利權）人: 曾俊華;張保國
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12R1/33
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于微生物制藥領域，具體涉及在濁點系統中轉化植物甾醇為甾體藥物重要中間體雄烯二酮的方法。

背景技術

甾體激素類藥物是臨床上不可缺少的一類藥物，對機體起著非常重要的調節作用。如腎上腺皮質激素具有抗炎癥、抗過敏、抗休克、抗變態反應等功效，廣泛用于治療類風濕性關節炎、支氣管哮喘和濕疹等皮膚病，可治療和緩解膠原性疾病、過敏性休克等難治或危險性疾病，也是治療愛迪森氏等內分泌疾病的不可缺少的藥物。各類性激素是醫治雄性器官衰退和某些婦科疾病的主要藥物，是口服避孕藥的主要成分。此外，甾體激素還具有改善蛋白代謝、恢復和增強體力、利尿降壓等作用。由于甾類藥物具有上述獨特的療效，所以這類藥物發展很快，已逐漸成為醫藥領域的重要門類。其世界年產量達幾萬噸，成為僅次于抗生素的第二大類藥物。

雄烯二酮是合成甾體類激素藥物重要的原料和關鍵的中間體，被廣泛應用丁風濕性關節炎、避孕利尿和各種將感染性炎癥控制等臨床上治療，市場前景非常廣闊，是當前國家急需解決的甾體激素藥物的重要原料和中間體。目前傳統的雄烯二酮的制備方法主要是薯蕷皂苷途徑：即從野生中藥材“穿地龍”、黃姜等植物中提取薯蕷皂苷，然后進行多步的化學合成。雄烯二酮傳統的化學合成生產方法的局限性在于：(1)化學工藝過程復雜，步驟繁瑣，累積產率低；(2)成本高、消耗大；(3)破壞環境。目前穿地龍資源十分緊張，人們無秩序、不科學采挖，不但破壞了地表植被，還破壞了生態環境。而人工種植黃姜由于種植周期長、大量占用耕地，且嚴重破壞地力，大量浪費了有限的土地資源。此外，提取皂素過程也嚴重污染環境，許多省份已禁止生產。雄烯二酮的另外一條合成途徑是通過微生物轉化技術將甾醇側鏈選擇性切除得到雄烯二酮。微生物降解甾醇側鏈生成雄烯二酮過程中所遇到的最主要的問題是甾醇底物在水溶液培養基中的溶解度問題。甾醇是一種疏水性化合物，在水中溶解度極低，這就使得底物與微生物細胞不能很好地接觸，導致轉化率偏低及轉化時間延長等一系列問題。因此，甾醇的微生物轉化，常常在遠低于底物溶解度的濃度下進行。在這種固體底物與溶解底物共存的多相體系中，轉化率不僅受酶活的影響，而且受到底物溶解速度的影響，從而進一步限制了微生物降解植物甾醇側鏈生成雄烯二酮的工業化生產。非離子表面活性劑溶液在達到一定溫度或有添加物存在的條件下，溶液自動分相而形成表面活性劑濃度很小的稀相和富含表面活性劑的凝聚層相。溶液分相時的溫度稱為濁點，該系統稱為濁點系統(cloud?point?system，CPS)。濁點系統除具有常規水-有機溶劑萃取系統的特征外，還具有其獨特的優越性。非離子表面活性劑在通常溫度下的揮發性低而被認為是一種綠色溶劑。濁點系統特殊的相結構，使凝聚層相具有高的含水率，從而提高了生物催化劑在系統中的穩定性。

由于濁點系統在甾體生物轉化過程中的獨特優勢，本發明公開了在濁點系統中轉化植物甾醇為雄烯二酮的方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中的缺陷，通過設計合理的濁點系統，提供一種高效、環保的轉化植物甾醇為雄烯二酮的方法。

本發明所要解決的技術問題由以下技術方案來實現：

本發明中微生物菌種為分子桿菌(Mycobacterium?fortuitum)ATCC29472；轉化底物是植物甾醇，可選豆甾醇、谷甾醇和菜油甾醇或它們的混合物，優先選用豆甾醇。

采用本發明方法進行轉化植物甾醇制備雄烯二酮時，為促進植物甾醇底物更好的溶解，克服傳統的有機溶劑兩相分配系統生物相容性差以及對微生物生長影響大的缺點，提高轉化效果，在轉化系統中添加非離子表面活性劑形成濁點系統。非離子表面活性劑可選用Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Span20、Span40、Span60、Span80、TritonX-100和TritonX-114，濃度為0.03％-0.1％。轉化培養基中的碳源可選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉或它們的組合，含量為0.5％-5％；氮源可選用酵母膏、蛋白胨、玉米漿、大豆粉、蠶蛹粉或它們的組合，含量為0.1％-3％；微生物轉化過程中可適當添加一定量的鎂鹽、磷酸鹽和鈉鹽等無機成分，轉化pH為6.0-9.0。