[發明專利]鑒別歐洲牛肝菌近緣種的分子特異性標記引物及方法

無效

• 申請號: 201310070420.2
• 申請日: 2013-03-05
• 公開（公告）號: CN103114149A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 魏海龍;李海波;胡傳久;王麗玲;付立忠
• 申請（專利權）人: 浙江省林業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一）技術領域

本發明涉及一種鑒別歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特異性標記引物，以及一種利用該引物對歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus進行快速辨別的方法。

(二）背景技術

隸屬牛肝菌目Boletales下Boletus屬的Appendiculati?Konrad&Maubl.ex?Lannoy&Estadès類群包括了B.appendiculatus?Schaeff.:Fr.、B.subappendiculatus?Dermek，Lazebn.&J.B.fechtneri?Velen.、B.pseudoregius(Huber)Estadès和B.regius?Krombh.五個Boletus種。這五個近緣種均起源于歐洲，其共同特征為子實體的菌柄上或多或少有網紋，全菌柄呈一致黃色，菌管和菌孔經常變藍；菌肉變藍或不變藍，但口嘗總具溫和口感；許多種在菌柄基部呈現些許粉紅色。

對近緣種B.appendiculatus與B.subappendiculatus標本辨別的典型特征是B.subappendiculatus不同于B.appendiculatus，其菌肉暴露在空氣中不變藍，或微弱變藍，或有時部分變藍；菌孔受傷不變藍，反而變暗；菌蓋米色、赭(黃)色;B.subappendiculatus的擔孢子的平均長寬比大于3。此外，在生境上不同，B.subappendiculatus生長在針葉林下。宏觀上的顏色差異和變色反應是辨別這二個近緣種的主要特征，微觀上的擔孢子大小僅作為次級辨別特征。盡管顏色差異和變色反應是辨別這二個近緣種的主要手段，但由于易受生境、氣候、土壤、子實體生長期、生理狀況等的影響而常常導致主觀判別上的偏差，而對于長期保藏的干標本，特別是古老標本、模式標本的重新鑒別研究，僅憑顏色、宏觀形態特征更是難以準確鑒定。因此，在大型真菌分類研究上，分子技術已成為了對標本輔助鑒定的重要手段。

真菌的核糖體基因rRNA的內轉錄間隔區(Internal?Transcribed?Spacer,ITS）區段的保守性基本上表現為種內相對一致，種間差異比較明顯，這一特點使得ITS區段不僅適合于屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關系分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定。對B.appendiculatus和B.subappendiculatus的二種的ITS測序數據顯示，B.appendiculatus和B.subappendiculatus的ITS1-5.8S-ITS2序列長度均為600～700bp，很難利用通用引物對(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4）的PCR擴增、普通電泳來進行準確辨別。對二個種的ITS序列比對顯示二者的局部序列存在較大差異，這為設計ITS特異引物，針對性地擴增ITS特異片段，以方便用于這二個近緣種的分子輔助鑒定提供了可能性。

(三）發明內容

本發明目的是提供一種可鑒別歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特異性標記引物，以及一種利用該引物對歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus進行快速辨別的方法。

本發明采用的技術方案是：

一種鑒別歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特異性標記引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5′-AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3′

下游引物：5′-ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3′。

該引物對是采用PCR技術，經過對歐洲牛肝菌標本B.appendiculatus和B.subappendiculatus的核糖體基因rRNA的ITS區序列的克隆測序，以得到的ITS序列進行堿基差異比對，并以此設計ITS特異性引物對。以該引物對對B.appendiculatus和B.subappendiculatus進行PCR擴增，可從B.subappendiculatus中獲得630bp大小的特異性片段，而B.appendiculatus則無法獲得擴增產物。

本發明還涉及所述的分子特異性標記引物在鑒別歐洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus中的應用。