[發明專利]一種從抗蟲棉種子中純化Bt毒蛋白的方法有效
| 申請號： | 201310070417.0 | 申請日： | 2013-03-06 |
| 公開（公告）號： | CN103145815A | 公開（公告）日： | 2013-06-12 |
| 發明（設計）人： | 王保民;張亮;曹振;郭素琴;譚桂玉;南鐵貴;李召虎 | 申請（專利權）人： | 中國農業大學 |
| 主分類號： | C07K14/325 | 分類號： | C07K14/325;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 抗蟲棉 種子 純化 bt 蛋白 方法 | ||
1.一種從抗蟲棉種子中純化Bt毒蛋白的方法，包括如下步驟：
（1）將抗蟲棉種子去殼后進行可溶性總蛋白的提取，得到溶液甲；
（2）將所述溶液甲進行60%飽和度的硫酸銨沉淀，離心收集沉淀；
（3）溶解步驟（2）得到的沉淀并進行透析，得到溶液乙；
（4）將所述溶液乙進行免疫親和層析，收集與抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的單克隆抗體特異結合的蛋白組分，即為Bt毒蛋白；所述抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的單克隆抗體為是由雜交瘤Bt2F9CGMCC?No.5162分泌產生的單克隆抗體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1）中，采用pH10.5、0.01M的CAPS緩沖液提取所述可溶性總蛋白。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟（3）中，用去離子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液調pH至10.5。
4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述免疫親和層析的步驟如下：（1）將所述溶液乙上樣于連接有所述抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的單克隆抗體的免疫層析柱；（2）用清洗液清洗柱子，去除雜蛋白；（3）用洗脫液進行洗脫，收集過柱后洗脫液，即為含有目的蛋白的溶液。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中還包括將所述過柱后洗脫液用Tris水溶液調pH至7.5的步驟。
6.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中還包括將所述過柱后洗脫液用Tris水溶液調pH至7.5然后進行透析的步驟。
7.如權利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述抗蟲棉為轉Bt?Cry1Ac蛋白的編碼基因的棉花；所述Bt毒蛋白為Bt?Cry1Ac蛋白。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于：所述抗蟲棉為國欣棉6號。
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