[發明專利]以黏土為載體的固定化脂肪酶的制備方法

有效

• 申請號: 201310070053.6
• 申請日: 2013-03-06
• 公開（公告）號: CN103131691A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 余旭亞;鄧濤;游金坤
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及固定化脂肪酶技術領域，特別涉及以黏土為載體的固定化脂肪酶的制備方法。

背景技術

脂肪酶（Lipase,?EC?3.1.1.3），是一類甘油三酯水解酶，它可以催化天然油脂進行水解，生成脂肪酸、甘油、甘油單酯或二酯，可以完成水解、酯化、轉酯、酯交換及合成等反應，被廣泛應用于油脂水解、食品加工、食品品質改良、疾病診斷、催化藥物合成、皮革生產、可生物降解的無污染洗滌劑的研發和生物柴油的生產等方面。然而，在實際使用過程中，游離酶即使在最適反應條件下也存在易失活、催化反應不穩定、與產物分離困難或分離成本高等缺點。另外，脂肪酶酶制劑一般是通過微生物發酵產生，或者是從動物、植物體內提取的，分離純化成本高，導致酶的生產價格較高，加上游離酶很難重復利用，導致酶制劑的使用成本提高，從而限制了游離酶在工業生產中大規模的應用。

固定化酶指經物理或化學方法處理后，使酶變成不易隨水流失即運動受限制，而又能發揮催化作用的酶制劑。與游離酶相比，固定化酶的優點有：可多次使用，且酶的穩定性提高；反應完成后，固定化酶易與底物和產物分離，而且酶活力降低較少，這樣就降低了生產成本；反應條件易于控制，有利于自動化生產。固定化酶通常所用的載體有活性炭、硅藻土、高嶺土、大孔樹脂、層狀硅酸鹽、改性硅膠、氧化鋁、殼聚糖、纖維素、聚乙烯醇、聚乙烯丙烯膠、卡拉膠、海藻酸納、磁性淀粉微球、蠶絲、蛋殼以及復合二氧化硅等。

酶的固定化方法常用的有吸附法、共價結合法、交聯法和包埋法。在此基礎上還出現了上述方法的結合法等。吸附法制備的固定化酶，酶與載體之間的結合力較弱，酶容易從載體上脫落下來，但此種方法具有酶活性中心不易被破壞和酶高級結構變化較少等優點。共價結合法的反應條件較為苛刻，同時由于發生了共價鍵結合，酶蛋白的高級結構容易產生變化，進而導致固定化酶的活力損失較大，甚至底物專一性等酶學性質發生改變。交聯法反應條件比較激烈，酶分子之間依靠化學鍵實現連接，因此酶失活現象較為嚴重。包埋法酶容易漏失，催化反應過程容易受傳質阻力限制，只適用于小分子底物和產物的反應。

酶固定化研究中，良好的載體是固定化酶成功的關鍵，所以在酶固定化領域，作為固定化載體的篩選和制備就成為了主要研究方向。

黏土是一種重要的礦物原料，由多種水合硅酸鹽和一定量的氧化鋁、堿金屬氧化物和堿土金屬氧化物組成，有很好的物理吸附性和表面化學活性。由于其具有豐富的反應基團，我們可以通過選擇不同的改性劑及其比例，實現對黏土結構和功能的調節。從而制備出符合需求的固定化酶載體。

發明內容

本發明的目的是提供一種以黏土為載體的固定化脂肪酶的制備方法，該方法工藝簡單，成本低廉，通過本發明方法制得的固定化脂肪酶不僅反應酶活高，而且比游離脂肪酶有著更好的催化活性。

為了達成上述目的，本發明通過下述技術方案得以解決：

（1）黏土載體的預處理：將黏土與水以質量比為5:2-4的比例混勻，在恒速攪拌器攪拌下，逐漸加入絮凝劑，加入比例為每克黏土添加0.3-0.7g絮凝劑，混勻后料漿成型、陰涼處干燥48-72h，干燥后的黏土在500-700℃下煅燒2-4h，粉碎，分篩成粒度為20-120目的顆粒；?

（2）黏土載體的羥基化處理：按每克預處理黏土添加10-15ml鹽酸的比例，在預處理后的黏土中加入鹽酸，并在60-80℃的水浴中充分攪拌10-30min后，抽濾，將得到的黏土用去離子水洗滌至洗滌液的pH=7，烘干；

（3）黏土載體的硅烷化處理：按每克羥基化處理的黏土添加3-4ml石油醚和0.03-0.04?mL硅烷化試劑的比例，在羥基化處理的黏土中加入石油醚和硅烷化試劑，充分混勻后，常溫下放置于搖床中反應1-3?h，待反應結束后，過濾，濾渣分別用石油醚和無水乙醇洗滌3-5次，烘干；

（4）脂肪酶的固定化：按給酶量為20-60mg/g的比例（即每克黏土給酶量為20-60mg）向pH值為3-8脂肪酶溶液中加入20-120目硅烷化黏土，密封，在20-40℃下振蕩固定0.5-4h后，抽濾，濾渣用緩沖液洗滌直至沒有蛋白洗脫下來，然后冷凍干燥，即得到固定化脂肪酶；

本發明中所述絮凝劑為聚丙烯酰胺、聚二甲基二烯丙基氯化銨、聚合氯化鋁中的一種。

本發明中所述鹽酸濃度為1-3mol/L。

本發明中所述硅烷化試劑為甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷中的一種。