[發明專利]Leber病之線粒體T3866C檢測試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201310069330.1
• 申請日: 2013-03-05
• 公開（公告）號: CN103173544A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 蔣萍萍;管敏鑫;冀延春;梁敏;張娟娟;徐靜
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種Leber病之線粒體T3866C檢測試劑盒，其特征在于，由置于盒體（8）內的DNA提取混合液（1）、擴增T3866C的PCR混合液（2）、針對T3866C設計的一對外引物（3）、針對T3866C設計的一對內引物（4）、限制性內切酶（5）、陽性對照（6）和陰性對照（7）構成，其中DNA提取混合液（1）由細胞裂解液和溶液Ⅰ組成，擴增T3866C的PCR混合液由脫氧單核苷酸、10×PCR緩沖液、MgCl₂、三蒸水和DNA聚合酶組成，針對T3866C設計的一對外引物有外前向引物F:?TACTTCACAAAGCGCCTTCC和外反向引物R:?AAGGATTATGGATGCGGTTG，針對T3866C設計的一對內引物有內前向引物F:?CAACACAAGAACACCTCTGATTACTCCTGCCAT?CATGACCCTTGGCCATAATATGATAGA和內反向引物R:?GAGAGTGCGTCATATGTTGTTCCT?AGGAAGA，限制性內切酶為限制性內切酶BglⅡ，陽性對照（6）是含有線粒體序列第3866位點發生T>C突變的酶切樣本，陰性對照（7）是不含有線粒體序列第3866位點發生T>C突變的酶切樣本，溶液Ⅰ的成分是蛋白酶K。

2.根據權利要求1所述的一種Leber病之線粒體T3866C檢測試劑盒，其特征在于，在擴增T3866C的PCR混合液（2）中添加0.1-0.2μl二甲基亞砜。

3.根據權利要求1或2所述的一種Leber病之線粒體T3866C檢測試劑盒在檢測與母系遺傳原發性Leber氏病相關的線粒體基因ND1T3866C突變中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，通過以下步驟實現：

（1）基因組DNA的提取：運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中提取基因組DNA；

（2）特異性PCR擴增：使用Primer?5.0軟件和Oligo7.0軟件根據SEQ?ID?NO:5所示的人類線粒體基因序列所設計的引物F_外/R_外、F_內/R_內是能擴增出包含上述原發性Leber氏病的線粒體突變位點的片段，F外/R外擴增出為線粒體DNA的核苷酸3150-4679，其序列為序列表中的SEQ?ID?NO:1、2；F_內/R_內擴增出為線粒體DNA的核苷酸3806-4058，其序列為序列表中的SEQ?ID?NO:3、4；

（3）酶切鑒定：將上述PCR產物用限制性內切酶BglⅡ對T3866C突變位點處進行酶切；

（4）突變檢測：聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，直接根據酶切PCR產物產生的DNA片段數量及DNA片段大小，檢測mtDNA是否發生T3866C突變。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟（1）所述從血標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中快速提取基因組DNA，通過以下方法獲得：

（1）血標本：取20～200μl血標本或1cm²的血濾紙片放入1.5ml離心管，加入900μl紅細胞裂解緩沖液，20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH?7.6，室溫靜置10min，充分裂解紅細胞，12000rpm離心1min，收集白細胞沉淀；

（2）帶毛囊的毛發：用體積比70%乙醇洗帶毛囊的毛發1?次，后再用蒸餾水沖洗毛發2次，在1.5ml離心管中分別放入2～4?根毛發，毛囊置于離心管底部，用干凈的剪刀剪去毛發高于離心管的部分；

（3）口腔粘膜刮片或唾液：收集唾液前，必須讓被收集者漱口，以除去口腔中過多的老化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙等物質，半小時內不要喝水、進食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，選擇如下方法收集唾液樣本：①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細胞，將約0.1ml唾液直接吐進EP管內；②生理鹽水漱口，吐進離心管內，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的離心管中，反復吹打后，12000rpm離心5min，除去上清，重復該過程一次；③用棉拭子反復刮拭面頰內壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入離心管中；④將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成大小約1cm²碎紙片置于離心管中；

然后用細胞裂解液和蛋白酶K對上述樣本進行消化裂解，利用鹽析法去除雜質，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于-20℃保存備用。