[發(fā)明專利]一種等溫擴(kuò)增核酸片段的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310068455.2
• 申請日: 2013-03-05
• 公開（公告）號: CN103146684A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王德國;曲海濤;張文超;張小輝;王樹芬;郭山鹿
• 申請（專利權(quán)）人: 許昌學(xué)院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州科維專利代理有限公司 41102
• 代理人: 辛國瑞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種等溫擴(kuò)增核酸片段的方法，特別是用與靶序列三個區(qū)域互補(bǔ)的一對引物通過鏈替代反應(yīng)擴(kuò)增核酸片段，該方法可作為特異基因片段的快速擴(kuò)增檢測手段。

背景技術(shù)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子技術(shù)的發(fā)展，研究開發(fā)了許多核酸擴(kuò)增技術(shù)。其中核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（專利ZL?00818262.0，ZL01810370.7，ZL01812204.3，ZL02815992.6，ZL200610080379.7），由于其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)速度快的特點(diǎn)，在核酸特異性擴(kuò)增和檢測領(lǐng)域具有取代PCR的趨勢，成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的主要原理是基于對靶序列的6個區(qū)域設(shè)計2對特異引物，利用一種鏈置換?DNA?聚合酶（Bst?DNA?polymerase），在65℃左右的等溫條件下保溫約60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，存在環(huán)引物的情況下，擴(kuò)增時間可進(jìn)一步縮短為40分鐘，同時具備不需要熱循環(huán)、擴(kuò)增效率更高、不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。

然而環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)需要針對核酸片段的6-8個區(qū)域設(shè)計引物，其中至少核酸片段的6個區(qū)域（F3_C、F2_C、F1、B1、B2_C和B3_C）與2對引物（實(shí)質(zhì)是3對引物：F3，F(xiàn)1_C-F2、B1_C-B2、B3）完全匹配才能進(jìn)行擴(kuò)增，如果加上環(huán)引物（LF、LB），需要設(shè)計4對引物，引物二聚體的產(chǎn)生很難避免，引物二聚體引起的假陽性問題也很難避免，限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種采用一對引物等溫擴(kuò)增核酸片段的方法，該方法可作為特異基因片段的快速擴(kuò)增檢測手段。

上述目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一對引物，其特征在于，針對核酸片段，采用PrimerPremier5.0等引物設(shè)計軟件，設(shè)計兩對類似于巢式PCR的又不具有重疊序列的引物F1、F2、R2、R1，其中，F(xiàn)2的互補(bǔ)序列F2_C連在F1的5’端；或R2的互補(bǔ)序列R2_C連在R1的5’端。

引物組合，根據(jù)上述引物設(shè)計方法，四種引物組合方式分別為F2_C-F1、R1；F1、R2_C-R1；F2_C-F1、R2；F2、R2_C-R1，任何一種組合方式都可以實(shí)現(xiàn)核酸片段的等溫擴(kuò)增。