[發明專利]從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法

有效

• 申請號: 201310068037.3
• 申請日: 2013-02-25
• 公開（公告）號: CN103571938A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 張鳳民;付英梅;宋武琦;錢均;李玉軍;李文靜
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

1.一種從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于：用PCR檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測。

2.根據權利要求1所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于：

步驟一：提取臨床標本中的總RNA；

步驟二：以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA；

步驟三：針對結核菌小RNA檢測引物和步驟二中合成的cDNA進行PCR檢測。

3.根據權利要求2所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于：步驟三中PCR反應體系包括2倍濃縮PCR反應緩沖液、dNTP、結核菌小RNA檢測引物、步驟二中合成的cDNA模板和DNA聚合酶。

4.根據權利要求3所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于：步驟三中PCR反應條件為，98℃10秒，68℃30秒，重復45個循環；PCR結果經過瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色后，在紫外燈下顯色拍照，有陽性條帶的標本為結核感染患者。

5.根據權利要求所述4的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于：步驟三中PCR反應體系為：2倍濃縮PCR反應緩沖液25微升、dNTP0.4mM、結核菌小RNA檢測引物1微升、步驟二中合成的cDNA模板1微升、DNA聚合酶1.25單位，加去離子水補充體積至50微升。

6.根據權利要求1至5任何一項所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的逆轉錄PCR方法，其特征在于：結核菌小RNA檢測引物可以為以下各組引物其中的一組：

第一組：正向引物SEQ?ID?NO.1：5′-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3′

????????反向引物SEQ?ID?NO.2：5′-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3′

第二組：正向引物SEQ?ID?NO.3：5′-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3′

????????反向引物SEQ?ID?NO.4：5′-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3′

第三組：正向引物SEQ?ID?NO.5：5′-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3′

????????反向引物SEQ?ID?NO.6：5′-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3′

第四組：正向引物SEQ?ID?NO.7：5′-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3′

????????反向引物SEQ?ID?NO.8：5′-CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3′

第五組：正向引物SEQ?ID?NO.9：5′-ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3′

????????反向引物SEQ?ID?NO.10：5′-AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-3′

第六組：正向引物SEQ?ID?NO.11：5′-CCACGTACTCGATCCCGTTG-3′

????????反向引物SEQ?ID?NO.12：5′-ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-3′

第七組：正向引物SEQ?IDNO.13：5′-AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3′

????????反向引物SEQ?ID?NO.14：5′-CGTGGGTATACCGAGGTCCA-3′

第八組：正向引物SEQ?ID?NO.15：5′-CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3′

????????反向引物SEQ?ID?NO.16：5′-AGGGACGACCCCCGCCAGGG-3′

第九組：正向引物SEQ?ID?NO.17：5′-CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3′

????????反向引物SEQ?ID?NO.18：5′-CGCACGTCAGCCCCACCCGT-3′