[發明專利]中成藥中生物類偽品DNA的PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201310067246.6
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103131781A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 唐卓;陳蓉
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都賽恩斯知識產權代理事務所(普通合伙) 51212
• 代理人: 張帆;肖國華

技術領域

本發明屬于中成藥真偽性的鑒定方法，具體地說是利用PCR技術檢測中成藥中生物類偽品DNA的一種方法。

背景技術

傳統的中成藥的質量控制僅限于對藥品性狀上的鑒別以及化合物的含量測定。中藥材制成中成藥，原藥材經多種制劑工藝制成中成藥時其本身的性狀已難以辨別；而中藥本身成分復雜，一味藥就含有幾十甚至數百個化合物，一個由多種中藥組成的中成藥，其中化學成分就更多了，目前僅選擇有限的幾種化學成分的鑒定來控制中成藥的質量，就為中成藥造假者提供了很大的空間，某些廠家為了降低成本，對于某些價格昂貴的藥材，常常以其他價格更低的藥材以假充真。本方法通過PCR的擴增，對經過高度工業加工的中成藥仍可以檢測出其中生物類樣品及其偽品的DNA,克服了現有技術的不足，可以簡便、快速、準確地判斷出中成藥中是否摻假，并且需要的樣品量極少，而且對幾乎所有生物類中成藥都適用。

發明內容

本發明的目的是提供一種PCR檢測中成藥中偽品DNA的方法。

本發明上述方法是利用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增中成藥中偽品特異性的DNA來檢測中成藥中偽品的DNA。

本發明的一種中成藥中生物類偽品DNA的PCR檢測方法是利用PCR擴增中成藥中生物類偽品特異性的DNA來檢測中成藥中生物類偽品的DNA，從而達到鑒定中成藥真偽性的目的。

本發明上述方法中，所檢測對象為中成藥，即含有生物類樣品的中成藥。

本發明的一種PCR檢測中成藥中生物類偽品DNA的方法包括下列步驟：

1）中成藥中生物類偽品DNA的提取；

2）PCR反應；

3）PCR擴增產物分析。

上述方法中，步驟1）中對于固體劑型的中成藥采用改良的CTAB法提取DNA；對于液體劑型的中成藥采用乙醇重結晶的方法提取。

上述方法中，步驟2）中對于DNA含量較高的中成藥采用普通PCR，對于DNA含量較低的中成藥采用巢式PCR。

具體地，本發明提供的一種中成藥中生物類偽品DNA的PCR檢測方法包括下列步驟：

1.中成藥中生物類偽品DNA的提取：

固體劑型的中成藥采用改良的CTAB法提取。①藥品適量在研缽中研磨成細粉取粉末少量(1.5mL?EP管的最小刻度0.1mL處)于1.5mL?EP管中，加入65℃預熱的CTAB提取緩沖液700μl，充分振蕩混勻，65℃溫浴2h;②樣品冷卻至室溫后加氯仿-異戊醇(24:1)600μl，顛倒混勻5分鐘;③7500r.min^-1離心10分鐘，轉移上清液至一新的EP管中;④加入等體積-20℃預冷的異丙醇，混勻，20℃放置30分鐘;⑤10,000r.min^-1離心15分鐘，棄上清液;⑥沉淀用70%乙醇、無水乙醇各洗滌一次，10,000r.min^-1離心3分鐘，棄上清液，室溫揮干乙醇，無菌高純水溶解DNA，備用。所述CTAB提取緩沖液含有：2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），100mM?Tris(pH8.0)，20mM?EDTA(pH8.0)，2.5M?NaCl。

液體劑型的中成藥采用乙醇重結晶的方法提取。①10mL藥液加入1mL3M醋酸鈉（pH=5.2）,30mL無水乙醇，30μl糖原（glycogen）,-20℃放置1.5h。②14,000r.min^-1離心10分鐘，棄上清。③70%乙醇洗滌，16,000r.min^-1離心5分鐘，棄上清。④揮干乙醇，無菌高純水溶解DNA，備用。

2.普通PCR反應體系及條件：

10×Taq?buffer5μl;Taq酶5個單位；

正向引物1μM;反向引物1μM；

dNTPs0.2mM；DNA提取液1μl.

95℃解鏈3分鐘；94℃變性30秒，50-65℃復性30秒，72℃延伸30秒，循環30次；72℃延伸5分鐘，得擴增樣品。

3.巢式PCR反應體系及條件：

第一輪PCR：

10×Taq?buffer5μl;Taq酶5個單位；

正向引物0.25μM;反向引物0.25μM；

dNTPs0.2mM；DNA提取液5μl.

95℃解鏈3分鐘；94℃變性30秒，50-65℃復性30秒，72℃延伸30秒，循環25次；72℃延伸5分鐘，得擴增樣品。

第二輪PCR同普通PCR操作。

4.PCR擴增產物分析：