[發(fā)明專利]口蹄疫病毒分型診斷環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其使用方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310067020.6
• 申請(qǐng)日: 2013-03-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103224994A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒明強(qiáng);薛強(qiáng);孫芳芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64;C12R1/93
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一套用于病毒分型診斷的引物組、試劑盒及其實(shí)時(shí)診斷方法，尤其涉及一套用于診斷O型、AsiaI型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、試劑盒及其使用方法，屬于口蹄疫病毒檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

口蹄疫(Food?and?Mouth?Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Food?and?Mouth?Disease?Virus，F(xiàn)MDV)感染偶蹄類動(dòng)物引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠(yuǎn)距離傳播的動(dòng)物疫病，會(huì)給畜牧養(yǎng)殖業(yè)，尤其是進(jìn)出口貿(mào)易造成巨大損失。口蹄疫病毒有O型、AsiaI型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型七種血清型，各血清型之間無(wú)交叉免疫反應(yīng)，我國(guó)曾出現(xiàn)過(guò)O型、A型和AsiaI型的疫情，C型和非洲型在周邊國(guó)家的出現(xiàn)也對(duì)我國(guó)威脅較大，因此建立快速、準(zhǔn)確的口蹄疫病毒分型診斷方法對(duì)于防控國(guó)內(nèi)疫情以及防止國(guó)外病毒的入侵具有重要的戰(zhàn)略意義。

目前，口蹄疫的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病原生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法三大類。其中，病原生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法對(duì)實(shí)際樣品具有一定的依賴性，尤其是對(duì)于免疫動(dòng)物、感染并有癥狀動(dòng)物與已感染但尚未出現(xiàn)發(fā)病癥狀動(dòng)物難以進(jìn)行區(qū)分和及時(shí)有效的判斷，而基于核酸檢測(cè)的分子生物學(xué)方法可從根本上解決這一難題，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR核酸分子診斷方法成為我國(guó)口蹄疫病毒診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)對(duì)溫度具有一定的依賴性，需要精準(zhǔn)的溫度循環(huán)變化設(shè)備作為技術(shù)保障，不僅增加了檢測(cè)時(shí)間，也增加了檢測(cè)的成本。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法是2000年由日本Notomi博士發(fā)明的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，更具有簡(jiǎn)便、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，該方法得到不斷完善，尤其在結(jié)果判定方面，已有多種肉眼可視的方法得到廣泛應(yīng)用，可從源頭上控制住由電泳開(kāi)蓋造成的氣溶膠污染，特別適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)以及田間檢測(cè)。中國(guó)發(fā)明專利200810034124和201210221684分別提供了O型和C型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，特別適合用于口蹄疫病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。然而，由于口蹄疫病毒核酸序列的型間差異比較分散，而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物的設(shè)計(jì)又相對(duì)比較復(fù)雜，目前尚未見(jiàn)有關(guān)口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增分型診斷研究的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的是提供一套用于口蹄疫病毒分型診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，由O型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、AsiaI型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、A型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、C型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SAT1型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SAT2型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SAT3型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組構(gòu)成，可用于O型口蹄疫病毒或者AsiaI型口蹄疫病毒或者A型口蹄疫病毒或者C型口蹄疫病毒或者SAT1型口蹄疫病毒或者SAT2型口蹄疫病毒或者SAT3型口蹄疫病毒或者其中的兩種或者三種或者四種或者五種或者六種或者七種型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。

所述各型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組是通過(guò)大量比對(duì)Genbank中下載的七種血清型口蹄疫病毒的核酸序列，針對(duì)特異性差異較大的VP1片段所設(shè)計(jì)，每種引物組均包括一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，A型引物組中另包括一條環(huán)引物(SEQ?No.13)，SAT3型引物組中另包括一對(duì)環(huán)引物(SEQ?No.30、SEQ?No.31)。引物組中的各引物可按一定比例配制成引物組溶液，用于制備口蹄疫病毒分型診斷試劑盒，其中內(nèi)引物與外引物的濃度比例確定方法為，分別按內(nèi)引物與外引物的濃度比例為2∶1-12∶1配制引物組溶液，構(gòu)成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增濁度檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)管中的濁度信號(hào)，獲得等溫?cái)U(kuò)增曲線。30min內(nèi)可監(jiān)測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)的引物組溶液的內(nèi)引物、外引物濃度比例為6∶1-12∶1，根據(jù)獲得濁度信號(hào)的時(shí)間及試劑使用量確定內(nèi)外引物對(duì)濃度的最優(yōu)比例，優(yōu)選比例為8∶1，環(huán)引物與內(nèi)引物的比例為1∶2。